中國對蝦細胞色素P450基因CYP4原核表達條件優化

張 喆,李 健,王 蕓,3,韓俊英,4

(1.中國水產科學研究院 黃海水產研究所,山東 青島 266071;2.中國水產科學研究院 南海水產研究所,廣東 廣州 510300;3.上海海洋大學 水產與生命學院,上海 200090;4.大連海洋大學 生命科學與技術學院,遼寧 大連 116023)

細胞色素P450酶系(cytochrome P450 monooxygenases,簡稱 CYP)是廣泛存在于幾乎所有生物體中的一類代謝酶[1],是一簇結構、性質相似而又有差異,由基因超家族編碼的含血紅素和硫羥基的結合蛋白,可以代謝多種內源物質(保幼激素及其類似物、蛻皮甾酮、脂肪酸和信息素等)和外源物質(藥物、環境毒物等),與生物的生長發育、環境適應密切相關,具有重要的生物學意義[2]。雖然海洋無脊椎動物體內細胞色素P450酶的含量較之哺乳動物要低很多[3],但其在海洋無脊椎動物中所起的作用卻受到人們極大的關注。

CYP4家族是細胞色素P450酶系中最古老的家族之一,大約起源于12.5億年以前[4],目前在人類、大鼠、魚及多種節肢動物體內均有發現,其功能涉及脂肪酸的 ω-羥化反應及保幼激素的降解等多種內源性物質的代謝,同時也參與多種外源化合物的代謝。有關無脊椎動物編碼 CYP4蛋白相關基因的研究在昆蟲中取得了較好進展,中國學者先后由致倦庫蚊溴氰菊酯抗性株及淡色庫蚊抗溴氰菊酯品系內克隆得到的細胞色素P450,經比對均屬于CYP4家族[5,6],說明CYP4家族可能與動物體內溴氰菊酯代謝有關。目前有關海洋無脊椎動物細胞色素P450的研究主要集中在基因克隆及功能分析方面。CYP4基因在許多海洋甲殼動物中都有發現,包括青蟹(Carcinus maenas)[7]、利莫斯螯蝦(Orconectes limosus)[8]、湖蝦(Penaeus setiferus)和美洲螯龍蝦(Homarus americanus)等,并研究了CYP4基因對苯并芘、多氯聯苯、多環芳烴等環境污染物的響應[9]。中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)主要分布于中國黃渤海和朝鮮西部沿海,是中國主要的養殖蝦類,而有關中國對蝦細胞色素P450基因的相關研究還未見報道。

作者根據本室克隆得到的中國對蝦CYP4基因cDNA序列設計引物,構建CYP4基因表達載體,實現該基因在大腸桿菌(Escherichia coli)中的原核表達,并對表達條件進行優化。為今后制備免疫抗體,建立免疫組化方法對中國對蝦CYP4基因功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗用中國對蝦購自山東省青島市膠州寶榮水產公司,于實驗條件下暫養10 d至RNA提取。

1.2 質粒與菌株

原核表達載體 pET28a由中國水產科學研究院黃海水產研究所海水養殖生物疾病控制與病原分子生物學實驗室饋贈;克隆菌株 DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司;表達菌株Rosetta(DE3)購自上海今邁生物科技有限公司。

1.3 試劑及工具酶

Ex-Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶及質粒提取試劑盒購自 TaKaRa公司;限制性內切酶 NheI、XhoI和低分子量標準蛋白購自NEB公司;膠回收純化試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產品;卡那霉素、IPTG、丙烯酰胺等均為國產或進口分析純試劑。

1.4 中國對蝦CYP4基因的RT-PCR擴增

1.4.1 引物合成與設計

根據本實驗室得到的中國對蝦CYP4基因cDNA序列(GenBank登陸號：GU218693.1)的開放閱讀框設計,利用Primer Primer 5 軟件設計1對特異性引物：上游引物 CYP4 - F：5’-GCGCTAGCTGGATTTACAAAAGACAGCAAAAGGTGTG-3’; 下 游 引 物CYP4-R：5’-GCCTCGAGTTATTTCCTGGGATGAAGCTTTAGGGGA-3’,由上海生工生物工程有限公司合成。預期擴增片段 1446bp,其中在上游和下游引物5’端各引入NheI和XhoI酶切位點(下劃線標出)和保護堿基。

1.4.2 目的片段的擴增與回收

采集健康中國對蝦肝胰腺提取總 RNA,反轉錄合成cDNA作為模板進行PCR擴增。PCR反應體系為：滅菌雙蒸水 17.25 μL,10×buffer(含 Mg2+) 2.5 μ L,dNTP(10 mmol/L) 2 μL,CYP4-F (10 mmol/L) 1μL,CYP4-R (10 mmol/L) 1 μL,cDNA 模板 1 μL,DNA 聚合酶0.25 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min,65℃退火2 min,72 ℃延伸2 min,30個循環;72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分離,回收目的條帶,方法參照瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行。

1.5 重組質粒p28a-CYP4的構建與鑒定

將回收的PCR產物與pET28a用Xho I 和Nhe I進行雙酶切,在T4連接酶作用下將CYP4基因與線性 pET28a載體連接,構建表達載體 p28a-CYP4,轉化 HD5α后利用 Kan抗性平板篩選陽性克隆進行PCR、雙酶切及測序(上海生工生物工程有限公司)鑒定,以確定開放閱讀框編碼正確。DH5α的轉化參照文獻[10]進行。

1.6 CYP4基因在大腸桿菌中的表達

將重組質粒p28a-CYP4轉化Rosetta (DE3)感受態細胞,構建重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4,pET28a轉化 Rosetta菌株構建重組菌株 Rosetta/pET28a,挑取轉化平板上的單克隆接種于 LB液體培養基(含Kan 30 μg/mL 和 Cam 34 μg/mL)中 37℃培養至 OD600約為0.4～0.6時,加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L,繼續培養6 h,取菌液1 mL離心收集菌體,重懸于SDS-PAGE上樣緩沖液中,充分打散后沸水浴 10 min,離心去上清進行SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況,方法參照文獻[10]。

1.7 重組菌株原核表達條件的優化

1.7.1 溫度

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到1個含100 mL LB液體培養基(含Kan 30 mg/L和Cam 34 mg/L)三角瓶中,于37℃條件下培養至 OD600為 0.5時加入 IPTG使其終濃度為 1.0 mmol/L,后將菌液均分為5份,分別于25、28、31、34和37℃誘導6 h。

1.7.2 IPTG濃度

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到1個含140 mL LB液體培養基(含Kan 30 mg/L和Cam 34 mg/L)三角瓶中,于37℃條件下培養至OD600為0.5時均分為7份,加入IPTG使其終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L,37℃繼續培養6 h。

1.7.3 誘導時機

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到7個含20 mL LB液體培養基(含Kan 30 mg/L和Cam34 mg/L)的三角瓶中, 37℃條件下培養至 OD600分別為 0.27、0.35、0.43、0.51、0.59、0.67和0.75,加入IPTG使其終濃度為1.0 mmol/L,37℃繼續培養6 h。

1.7.4 誘導時間

將重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4按照 1%接種量分別接種到1個含20 mL LB液體培養基(含Kan 30 mg/L和Cam 34 mg/L)的三角瓶中,于37℃條件下培養至 OD600為 0.5,加入 IPTG使其終濃度為 1.0 mmol/L,37℃繼續培養,分別于加入IPTG后的1、2、3、4、5、6、7、8 和 24 h 取樣。

1.7.5 蛋白質含量測定

用紫外分光光度計和Gel-pro Analyzer 4.5軟件分析蛋白樣和電泳圖譜,得到總蛋白含量和重組蛋白含量。

2 結果

2.1 p28a-CYP4表達載體PCR和酶切檢測結果

由圖1可以看出,重組質粒經雙酶切后,得到大小約為1500bp和5200bp的兩個片段,與預期結果一致;PCR結果得到與目的片段大小相符的產物;測序結果顯示CYP4基因開放閱讀框連接正確,成功構建重組質粒p28a-CYP4。

圖1 重組質粒的酶切及PCR檢測Fig.1 Identification of the recombinant plasmid by enzyme digestion and PCR

2.2 CYP4基因在Rosetta中的原核表達

由圖2中可以看出,Rosetta/p28a-CYP4重組菌株誘導后在56.0 kDa處有1條顯著表達條帶,與軟件預測大小相一致,表明中國對蝦CYP4基因實現在E.Coli中的表達。

2.3 重組菌株原核表達條件優化

2.3.1 溫度對CYP4基因表達的影響

由圖3和圖4可知,25 ℃誘導菌體總蛋白含量最高,為 46.41 g/L,而目的蛋白僅占總蛋白含量的14.72%;37 ℃誘導時目的蛋白含量達到7.93 g/L,占總蛋白的25.50%。

圖2 重組菌株Rosetta/28a-CYP4誘導表達的SDS-PAGE分析Fig.2 Induced expression of Rosetta/28a-CYP4 analyzed by SDS-PAGE

圖3 Rosetta/p28a-CYP4在不同溫度誘導下表達的 SDSPAGE分析Fig.3 Expression of Rosetta/28a-CYP4 induced at different temperatures analyzed by SDS

2.3.2 IPTG濃度對CYP4基因表達的影響

由圖5和圖6可知,當IPTG濃度為0.8 mmol/L時菌體總蛋白最高,為 39.0 g/L,此時目的蛋白為9.95 g/L,占總蛋白的 25.51%;當 IPTG濃度為 1.2 mmol/L時,菌體目的蛋白達到14.32 g/L,占總蛋白的52.41%。

圖4 不同溫度誘導條件下Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.4 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 induced at different temperatures

圖5 Rosetta/p28a-CYP4 在不同 IPTG濃度誘導下的SDS-PAGE分析Fig.5 Expression of Rosetta/28a-CYP4 induced with different concentrations of IPTG analyzed by SDS

2.3.3 誘導時機對CYP4基因表達的影響

圖7、圖8所示為菌液不同OD值誘導目的蛋白表達差異。由圖中可知,當菌液OD600為0.75時誘導菌體總蛋白含量最高,為 46.74 g/L,此時目的蛋白占總蛋白的 20.88%;當 OD600為 0.59時,目的蛋白含量達到10.33 g/L,占總蛋白的25.51%。

2.3.4 不同誘導時間對CYP4基因表達的影響

由圖9和圖10可以看出,隨著誘導時間的推移,菌體總蛋白含量呈現先增加后下降的趨勢,在5 h達到37.73 g/L,此時目的蛋白占總蛋白的23.05%;誘導6 h時總蛋白為34.72 g/L,目的蛋白則為8.86 g/L,占總蛋白的25.51%,達到最大值。

圖6 不同IPTG誘導條件下Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.6 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 inducted with different IPTG concentrations

圖7 Rosetta/p28a-CYP4不同OD600誘導SDS-PAGE分析Fig.7 Expression of Rosetta/28a-CYP4 induced at different OD600

3 討論

3.1 中國對蝦CYP4基因的原核表達

圖8 不同時機誘導Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.8 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 induced at different OD600

圖9 Rosetta/p28a-CYP4不同誘導時間SDS-PAGE分析Fig.9 Expression of Rosetta/28a-CYP4 inducted at different time

圖10 不同誘導時間Rosetta/p28a-CYP4蛋白含量變化Fig.10 Variation of protein contents of Rosetta/28a-CYP4 induced at different times

細胞色素P450是機體對內、外源物質,尤其是藥物進行生物轉化的重要酶系,作為細胞色素 P450最古老的家族之一,CYP4基因在許多海洋無脊椎動物中都有發現[9],且在海洋軟體動物Mytilus edulis微粒體中檢測到了其在蛋白質水平的表達[11],而有關海洋甲殼動物CYP4基因功能的研究卻十分有限。除了參與外源物質的代謝以外,CYP4基因在節肢動物荷爾蒙代謝中也起著重要作用[4]。Aragon等[12]發現CYP4C15基因在小龍蝦(Orconectes limosus)Y-器官中顯著表達,提示該基因可能參與了蛻皮激素的生物合成。研究P450基因的結構是了解其在生物體生長發育及內外源物質代謝所起功能的重要環節。

作者構建了中國對蝦CYP4基因重組載體p28a-CYP4,并首次實現該基因在大腸桿菌的原核表達。張寶等[13]將CYP3A4基因同時接入 pET- 22b(+)、pET-28b(+)和 pET-32a(+)3種載體中,結果只有pET-32a(+)-CYP3A4可以表達目的蛋白,該蛋白大約占細菌總蛋白的40%。本研究表明pET28a載體可以實現中國對蝦CYP4基因的表達,且目的蛋白占總蛋白的含量可以達到50%以上,說明pET28a是有效的CYP4基因表達載體。關樺楠等[14]克隆了青楊脊虎天牛(Xylotechus rusticus)CYP4G2基因片段并在E.Coli中實現原核表達,SDS-PAGE電泳檢測到一條22.0 kDa大小的外源蛋白表達。李秀蘭等[15]將淡色庫蚊(Culex pipieus)CYP4E2r6基因構建重組載體,在BL21中實現原核表達,外源蛋白大小約為 42.0 kDa。中國對蝦CYP4基因編碼蛋白質全長512氨基酸,表達蛋白大小為 56.0 kDa左右,與淡色庫蚊CYP4E2r6表達蛋白大小接近,大于青楊脊虎天牛CYP4G2表達蛋白,說明CYP4基因在不同物種之間差異較大。

3.2 Rosetta/p28a-CYP4原核表達條件的優化

重組菌體的蛋白表達量受到誘導劑濃度、接種量、誘導溫度、誘導時間等諸多因素的影響。

董元凌等[16]在進行家蠶CYP337A1基因的原核表達研究時發現誘導 1～2 h隨時間推移目的蛋白含量增加,而2 h后隨著誘導時間的延長,目的蛋白表達量無明顯差異;在誘導溫度的比較上發現,溫度為 25 ℃時,誘導表達蛋白量較低,溫度為 32 ℃和37 ℃時,表達量較高但蛋白量差異不明顯;IPTG濃度為 0.6 mmol/L時目的蛋白占總蛋白含量最高,而當IPTG濃度大于0.6 mmol/L時,其誘導表達量不受IPTG變化的影響,認為這是由于 IPTG對細菌生長有一定的抑制作用導致[17]。潘濱等[18]在進行煙草曲莖病毒復制相關蛋白基因的原核表達條件優化時發現,IPTG濃度 0.5 mmol/L時目的蛋白表達量最高,隨著IPTG濃度增加目的蛋白表達量有下降趨勢,誘導時間以4 h為宜,過長或過短都會影響蛋白的積累量。岳盈盈等[19]實現了風疹病毒包膜糖蛋白E1的原核表達并對其表達條件進行了優化,發現誘導溫度、IPTG濃度及表達時間均對重組蛋白有較大的影響。

本研究發現誘導溫度、IPTG濃度、誘導時機及時間均可影響重組蛋白及菌體總蛋白的表達量。37 ℃誘導時菌體目的蛋白含量最高,與上述研究結果一致。IPTG對目的蛋白占總蛋白含量的影響最為顯著,IPTG為1.2 mmol/L時,目的蛋白占總蛋白含量最高,與之前的研究結果并不一致,可能是由于表達菌株、重組載體不同導致。誘導時間則對目的蛋白的含量影響最為明顯,誘導5 h時目的蛋白含量最高,其后呈下降趨勢,與有關文獻報道一致[18]。

通過條件優化認為重組菌株 Rosetta/p28a-CYP4的最佳誘導溫度為 37 ℃,最佳 IPTG濃度為 1.2 mmol/L,最佳誘導時機及誘導時間分別為 0.59和 6 h。中國對蝦CYP4基因的原核表達對進一步在蛋白水平上研究該基因的功能具有一定意義。

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