從養殖貝類和大菱鲆分離的海洋發光弧菌的分類地位分析

劉 斌,葉德贊,Günter Jost,林 義,黃翔玲,鄭森林

(1.國家海洋局 第三海洋研究所,福建 廈門 361005; 2.國家海洋局海洋 生物遺傳資源重點實驗室,福建廈門 361005; 3.德國萊布尼茲波羅的海研究所,羅斯托克 D-18119)

弧菌是海洋環境中常見的條件致病菌,在某些環境條件下可引起水產養殖動物的病害。迄今已有分離報道的水產致病性弧菌達10多種,危害的對象包括魚類、甲殼類和貝類動物等[1]。劉文華等[2]對廈門潯江牡蠣養殖區弧菌的研究表明,水體弧菌密度與牡蠣體的弧菌密度呈密切相關性,是引起養殖區牡蠣嚴重死亡的原因;Vibrio campbellii可引起魚、蝦和貝類的大量死亡[3]; 發光弧菌V.fischeri可引起大黃魚體表潰爛癥[4]; 而同樣具有發光特性的V.harveyi感染對蝦幼體后即在幼體體內大量繁殖,致使對蝦幼體活力下降,游泳能力變差,體色發白,部分肌肉壞死,是一種在對蝦育苗和養殖中都經常發生的細菌性疾病,具有發病急,傳播廣,感染力強,致死率高和防治困難等特點,給世界養蝦業造成了巨大的經濟損失[5-6]。

作者采用ARDRA、16S rDNA序列測定、Biolog碳源代謝分析及藥敏試驗等方法,對從福建省晉江市附近水產養殖場的貝類軟組織及波羅地海大菱鲆腸道內含物中分離得到的 16株發光細菌的分類地位進行了分析,也為防治海水養殖中潛在的由發光弧菌引發的病害提供了幫助。

1 材料與方法

1.1 培養基及主要試劑和儀器

發光菌培養基：蛋白胨5.0g,酵母膏1.0g,甘油3 mL,陳海水1000 mL,瓊脂15 g,pH 7.0; 引物由上海英駿生物技術有限公司合成,DNA Marker、Ex Taq酶及限制性內切酶AfaⅠ、MspⅠ均購自大連Takara公司; Biolog微生物自動鑒定系統由美國Biolog公司生產; 藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 菌株來源

將2008年5月采集自福建省晉江市附近營前、白沙及江崎水產養殖場正常生長狀態下的花蛤及牡蠣樣品去除貝殼后研磨,取5 g經充分研磨的樣品置于45 mL內置玻璃珠的無菌生理鹽水中,振蕩混勻,取上清液稀釋為 10-1,10-2兩個梯度,各梯度分別吸取 100 μL,用涂布棒均勻涂布于發光菌培養基上,25℃恒溫培養24 h,于暗室中挑取發出熒光的菌株。經分離純化,共得到12株發光細菌。采取同樣的方法于2009年7月在購自市場的波羅地海大菱鲆腸道內含物中分離得到4株發光細菌。

1.3 細菌基因組DNA的提取

細菌基因組DNA的提取參照《精編分子生物學實驗指南》[7]中的細菌基因組DNA的小量制備方法,并將提取的DNA模板儲存于－20℃冰箱中。

1.4 細菌16S rDNA的PCR擴增

所用引物為細菌16S rDNA通用引物,擴增正向引物 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′; 反向引物 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min; 94 ℃變性40 s,56℃退火40 s,72℃延伸2 min,30個循環后,72℃最終延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 16S rDNA PCR產物的ARDRA分析

PCR擴增產物用限制性內切酶AfaⅠ、MspⅠ進行雙酶切,酶切反應體系為 20μL,其中 PCR 產物10 μL,內切酶各 0.5 μL,相應的 10×Buffer 2 μL,0.1%BSA 2 μL,去離子水 5 μL。37 ℃恒溫 3 h。酶切產物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 16S rDNA PCR產物測序及系統發育樹的構建

PCR產物經純化后送上海英駿生物技術有限公司測序。用EzTaxon Server version 2.1對所得到的16S rDNA序列進行分析,并用Mega 4.1軟件包采用Neighbor-Joining算法自展 1000次進行系統發育樹的構建。

1.7 Biolog碳源代謝分析

按照 Biolog微生物鑒定操作步驟,調整接種菌懸液濁度為28%T,接種至96孔GN2微孔鑒定板中,于25 ℃培養至第24小時 、48小時 、72 小時,結合“人工”及“自動”兩種讀板模式,分別測定3次。采用 NTSYS-pc 2.10e軟件對讀取結果進行聚類分析。

1.8 藥敏試驗

藥敏試驗采用 K-B紙片瓊脂擴散法進行,于25℃恒溫培養24 h后取出,記錄各藥敏紙片的抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑7 mm)。按CLSI抗菌藥物敏感性試驗執行標準(2009年版)判斷藥敏結果。

2 結果與分析

2.1 發光細菌的分離、形態觀察及染色

經分離純化得到16株發光細菌(表1),經革蘭氏染色及KOH拉絲法驗證,這些菌株均為革蘭氏陰性菌; 在發光菌甘油培養基上的菌落均為圓形,淺黃色,表面光滑濕潤,邊緣整齊或呈鋸齒狀,隆起形狀分扁平和微凸; 油鏡下觀察,呈長桿狀、短桿狀或弧狀; 在黑暗中均發射淺綠色熒光。

2.2 ARDRA結果分析

研究表明[8],每一個菌種的16S rDNA都有一個獨特的酶切圖譜,每種代表一個操作分類單位(即OTU),用16S rDNA序列的ARDRA分析可以區分出菌種。本研究選用限制性內切酶AfaⅠ和MspⅠ對16株發光菌16S rDNA的PCR擴增產物進行雙酶切分析,其結果見圖 1。根據圖 1中的限制性酶切圖譜,可將 16株菌分為 3組,即 3個不同的 OTUs,其中OTU2包含菌株FY-6和FJ-2,屬于OTU3的僅有菌株FJ-1,其余13個菌株則均屬于OTU1。

表1 16株發光細菌來源Tab.1 The sample sources of 16 luminous bacteria

2.3 16S rDNA序列測定及系統發育分析

根據發光細菌菌落和細胞形態、16S rDNA序列的ARDRA指紋圖譜及樣品來源的不同,選取其中5個菌株進行 16S rDNA序列測定并進行系統發育分析。所有測序菌株均與數據庫中已知標準菌株的16S rDNA序列具有較高的相似性(表 2)。結合實驗菌株16S rDNA序列的最高相似性及在系統發育樹(圖 2)中所處的分支可知,所有5株發光菌株均屬于Vibrio屬,分別與V.campbellii,V.orientalis,V.fischeri及V.azureus具有最近的親緣關系,其中菌株 FY-1和FB-1雖同屬OTU1,鑒定結果卻有所不同,但兩株菌在系統發育樹中的位置較為接近。

圖1 限制性內切酶AfaⅠ和MspⅠ雙酶切16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of AfaⅠ+ MspⅠdigestion of PCR-amplified 16S rDNAs

2.4 Biolog碳源代謝分析

微生物對碳源的利用能力是表征微生物生長情況的主要指標[9]。本研究中 5株海洋發光弧菌的Biolog碳源代謝分析結果與數據庫中標準菌株的相似性較低,無法鑒定至種。5株菌對 95種碳源的利用率及聚類分析結果見圖3,各株菌的碳源利用圖譜均有所不同,其中FY-1可利用57種碳源,FB-1可利用54種,FJ-1則可利用34種,而FJ-2與FY-6的碳源利用譜較窄,分別可利用18種和14種碳源,但各株菌均可利用吐溫 40、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-纖維二糖、D-果糖、α-D-葡萄糖、L-天冬酰胺酸、L-谷氨酸、甘氨酰-L-天門冬氨酸、肌苷和尿苷等10種碳源。由圖3中的碳源代謝聚類分析結果可知,菌株FY-6與FJ-2碳源利用情況雖有所差異,但處于同一分支,相似度較高,而其他菌株的碳源利用情況差異較大。

2.5 藥敏試驗

選用復方新諾明、氟哌酸等11種藥物進行了藥敏性試驗。依據2009年版CLSI抗菌藥物敏感性試驗執行標準判斷藥敏結果(表 3)。試驗結果表明,各株菌對同一藥物的敏感性多有不同,但系統發育分析中親緣關系較近的FY-6及FJ-2也具有較為相似的藥物敏感性,且所有菌株均對復方新諾名和慶大霉素等敏感。

3 討論

近些年來,分子生物學手段發展迅速,一些新的基于細菌基因組序列的分子生物學方法,如ARDRA、rep-PCR、RAPD等,為細菌的分離鑒定和多樣性研究提供了有力的工具。ARDRA方法可在16S rDNA序列水平上區分細菌種的差異。但研究中也發現ARDRA存在著一定的局限性：用ARDRA區分不同的 16S rDNA片段的精確性有賴于所選用的限制性內切酶的種類和數量,選用不同的酶可能會劃分出不同的OTUs,尤其是要區分同一個屬內的不同種時需要用幾種不同的酶消化,以綜合分析得到的電泳圖譜[10]。本研究中,通過AfaⅠ和MspⅠ兩種酶的ARDRA方法篩選菌株,16株發光細菌可分為3個OTUs,但隨后的序列測定和系統發育分析結果表明,兩種酶的 ARDRA方法可在屬水平上對細菌做有效甄別,也可以區分同一屬內親緣關系較遠的種,但難以區分同一屬內的近緣種。

表2 5株發光細菌的16S rDNA序列相似性Tab.2 Similarity of 16S rDNA sequences from the five luminous bacteria

圖2 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of the five luminous bacteria and relating species

圖3 發光弧菌對 95種有機碳源的利用率及聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis of the utilizing rates of 95 C-Sources by the 5 strains

16S rDNA序列測定及系統發育分析表明,選取的5株發光菌均屬于Vibrio屬,其中菌株FJ-1的近緣種為發光細菌V.fischeri; 來源不同的菌株FY-6及FJ-2與具有發光特性的V.orientalis以100%的置信度處于同一分支,親緣關系最近;V.azureus為最近報道的一發光新種[11],作者自波羅地海分離得到的發光菌株FB-1與其具有最大的16S rDNA序列相似性達98.613%; 而發光菌株FY-1與V.campbellii序列相似性最高(99.926%),但未見有關于V.campbellii發光的正式報道。謝文陽等[12]從臺灣沿岸淺水區域分離出來 4株表型特性非常相似的發光菌株,鑒定為V.harveyi類似種,但也大多與V.campbellii而非V.harveyi,具有最高的16S rDNA序列相似性。

表3 11種藥物對5株發光弧菌的抑菌圈直徑及判斷結果Tab.3 Sensitivity of the five luminous bacteria to 11 drugs

Biolog系統是一種測定微生物對95種不同單一碳源利用能力的快速、簡便方法,適用于陸地環境、臨床細菌鑒定[13]。本研究中利用Biolog系統得到的5株海洋發光弧菌的碳源利用圖譜均有所不同,但無法鑒定至種,主要是因為海洋細菌的生長條件和陸地細菌有較大區別,該系統的某些實驗條件不適合海洋細菌,并且目前該鑒定系統收集的標準菌株數據庫尚無足夠的海洋細菌的特征資料,可鑒定的種類有限[14]。藥敏試驗也屬于菌種鑒定的生化指標范圍,其結果可為海水養殖中潛在的由發光弧菌引起的病害的防治提供幫助。兩種方法得到的菌株 FY-6和 FJ-2的實驗結果較為相似,與 ARDRA及 16S rDNA序列測定方法一樣,可將其劃分至同一群體,推測為V.orientalis的不同亞種。

一般來說,基于16S rDNA序列的分析可將細菌鑒定到屬的水平,常規生理生化特征研究方法依然是將細菌鑒定到種的最精確的方法。結合ARDRA、16S rDNA序列測定、Biolog碳源代謝分析及藥敏試驗等方法,雖無法鑒定海洋細菌至種,但可將細菌區分為屬內分類地位相一致的不同群體,為后續更精確的在生理生化方面鑒定細菌提供參考依據。

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