一株抑制滸苔生長海洋細菌的分離與鑒定

汪靖超,辛宜軒

(1.青島大學 生物系,山東 青島 266071; 2.青島第二中學,山東 青島 266061)

滸苔(Enteromopha prolifera(Müller) J.Ag.)是一種大型經(jīng)濟海藻,屬綠藻門、石莼目、石莼科、滸苔屬,廣泛分布于河口、近海灘涂,自然繁殖能力和環(huán)境適應(yīng)能力特別強。適度的滸苔生長會消耗水體中的營養(yǎng)鹽和浮游生物,在一定程度上能降低赤潮的發(fā)生幾率,但滸苔等綠藻的瞬間大量爆發(fā)則會形成綠潮。綠潮現(xiàn)在已成為全世界范圍的富營養(yǎng)化難題,法國Brittany海區(qū)綠藻大規(guī)模爆發(fā),每年打撈的綠藻可達85 000m3,日本從20世紀70年代起每年均有綠潮爆發(fā),橫濱市每年花費在打撈綠藻上的費用可達4 000萬日元[1-3]。2007年7月和2008年6月,青島近海海域發(fā)生了大規(guī)模滸苔漂浮現(xiàn)象,政府和民間動員大量人力物力,兩年分別打撈出 7000多噸和100多萬噸滸苔[4-5]。

溶藻細菌(Algae-1ysing bacterium)能夠通過直接或間接方式,抑制藻類生長或殺死藻類,從而溶解藻細胞。在利用物理、化學以及其他方法治理水華都不太理想的情況下,溶藻細菌的使用已經(jīng)引起越來越多學者的關(guān)注[6-7]。作者從青島海域的海泥中分離純化了一株可抑制滸苔生長的海洋細菌 EP23,并對該菌株進行了鑒定,以期為滸苔的生物防治研究提供理論根據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

滸苔采自青島第一海水浴場,海泥取自青島大麥島,實驗用海水取自青島奧帆賽場。16S rDNA引物合成、DNA序列分析由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成,克隆所需工具酶購自大連寶生物工程公司,其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 培養(yǎng)基

實驗用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基均用陳海水配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 滸苔培養(yǎng)

接種滸苔于無菌海水中,光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為 20℃,光照強度為 60 μmol/(m2.s),光: 暗為12 h:12 h,每天搖動培養(yǎng)瓶3次。

1.3.2 溶藻細菌的分離

稱取10 g海泥,放入盛有90 mL無菌海水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,振蕩30 min。懸液稀釋后涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)48 h,對培養(yǎng)出的眾多細菌再劃線分離純化,獲得單個菌落。

1.3.3 溶藻細菌對滸苔抑制活性的測定

分別挑取分離的各菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中,28℃振蕩培養(yǎng)24 h,10 000r/min離心5 min,取上清,按照 1 : 100的比例(V/V)加入滸苔培養(yǎng)液中,混勻,20℃繼續(xù)培養(yǎng)3 d,觀察滸苔變化。

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 菌體形態(tài)學觀察

牛肉膏蛋白胨平板劃線培養(yǎng)待鑒定菌株,28 ℃恒溫培養(yǎng)1~3 d,進行形態(tài)學、革蘭氏染色、鞭毛染色和芽孢染色觀察,具體方法參照文獻[8]進行。

1.3.4.2 生理生化特征的測定

參照文獻[8]介紹的方法進行。

1.3.4.3 基因組DNA的提取和16S rDNA的擴增

參照文獻[9-10]的方法進行 DNA的提取、引物設(shè)計及PCR擴增。

1.3.4.4 克隆載體的構(gòu)建、測序及分子生物學鑒定

回收PCR產(chǎn)物,連接到pMD-18T Simple載體,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,堿法提取質(zhì)粒,酶切后進行電泳分析并測序。將測序結(jié)果用NCBI的Blast程序進行序列同源性比對。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離

從實驗海泥中分離得到了特征明顯的57株細菌,測定各菌株對滸苔的毒性,有8株菌株對滸苔有抑制作用,其中毒性最強的為第23號菌株,該菌株編號為EP23。

2.2 菌株EP23的形態(tài)特征

EP23菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上 28℃培養(yǎng)24 h后,形成的菌落圓形、扁平、灰白色、不透明、黏稠、大小中等、表面不光滑、邊緣不規(guī)則。草酸銨結(jié)晶紫常規(guī)染色,光鏡下觀察該菌為桿狀,單生、雙生或多個細胞連接成鏈狀,菌體大小為 0.7~0.8 μm×2.5~3.5 μm。懸滴法觀察EP23菌株具有很強的運動性,硝酸銀鞭毛染色觀察到細胞有周生鞭毛;Schaeffer-Fulton氏染色法觀察到大量菌體內(nèi)有芽孢,未見伴孢晶體,芽孢中生,橢圓形,芽孢囊不膨大;革蘭氏染色陽性。

2.3 生理生化特征

EP23菌株的生理生化特征見表1。

表1 EP23菌株的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain EP23

綜合該菌株的菌落形態(tài)、個體特征及其生理生化反應(yīng)特性,參照文獻[11-12],將 EP23菌株初步鑒定為彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)。

2.4 16S rDNA序列分析

由PCR擴增產(chǎn)物電泳圖(圖1)可見,擴增得到目的片段長約 1.5 kb左右,與 16S rRNA序列長度一致。將擴增的16S rDNA序列克隆后測序得到1451 bp長度的序列,該序列在 GenBank中的登錄號為GQ279347。將該序列與 GeneBank庫中已有的細菌16S rDNA序列進行BLAST比較后,發(fā)現(xiàn)該菌株與彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexusstrain KSC_SF9c)16S rDNA同源性高達99.7%,結(jié)合細菌的常規(guī)鑒定結(jié)果,將該菌株鑒定為枯草芽孢桿菌。

2.5 EP23對滸苔的毒性

EP23菌株經(jīng)過液體培養(yǎng)后,經(jīng)過高速離心去除絕大部分菌體,上清液按體積1 : 100的比例,加入滸苔的培養(yǎng)液,3 d后藻體開始變黃,5 d后滸苔全部死亡,葉綠素分解,說明 EP23的胞外產(chǎn)物對滸苔具有明顯的毒性。

圖1 EP23菌株基因組DNA的提取與16S rDNA的擴增Fig.1 Genomic DNA and 16S rDNA of strain EP23

3 討論

目前對于滸苔的爆發(fā),除了動用人力打撈之外,缺少有效的控制方法。雷清新等[13]研究了銅離子對緣管滸苔(E.linza)的毒性,結(jié)果顯示0.5 mg/L的Cu2+可使緣管滸苔迅速死亡。孫修濤等[14]研究了鹽度、溫度、黑暗、酸度等4個理化環(huán)境因子以及生石灰、硫酸銅、含氯消毒劑、7種除草劑對滸苔生長的影響,結(jié)果顯示滸苔是一種具有極強抗逆能力的海洋植物,各種試驗用藥物均需要較高的濃度才會對滸苔有毒性,而藥物的大量使用又會對海洋環(huán)境造成新的污染。

利用溶藻細菌控制水華的研究在國外已有數(shù)十年歷史,近年來,不少國外研究者認為: 水華和赤潮的突然消亡可能與溶藻細菌的感染有關(guān)[7]。國內(nèi)外陸續(xù)報道了多種具有溶藻活性的細菌,Reim[15]曾報道了一株桿菌屬細菌對藍藻有溶藻活性,該細菌通過分泌胞外物質(zhì)殺死藍藻細胞。細菌的溶藻方式一般有兩種: 一是直接溶藻,也就是直接進攻藻細胞,它需要菌體與藻細胞直接接觸,甚至侵入藻細胞內(nèi)部;二是間接溶藻,主要包括細菌同藻類爭奪營養(yǎng)或細菌分泌胞外物質(zhì)溶藻[6]。本文分離到的彎曲芽孢桿菌EP23,其培養(yǎng)液高速離心后,上清液對滸苔具有明顯毒性,表明彎曲芽孢桿菌EP23是通過分泌胞外物質(zhì)的間接方式進行溶藻的,作者也將對該菌分泌的毒素性質(zhì)及其抑制滸苔生長的機理作深入的研究。

彎曲芽孢桿菌EP23的實際應(yīng)用,還有幾個問題需要加以解決,首先,雖然該菌本身就是從海泥中分離而來,也未見彎曲芽孢桿菌是魚、蝦、貝等海洋生物致病菌的報道,但該菌對于廣大海洋生物是否存在毒性,施用后能否造成二次污染,還需要進行廣泛深入的研究; 同時,滸苔大爆發(fā)根本原因是水體的富營養(yǎng)化,而細菌溶藻后水體中大量的氮、磷并未被去除,富營養(yǎng)化問題仍然存在,利用細菌進行溶藻,雖然可在表面上消除滸苔爆發(fā)形成的綠潮,并不能從根本上解決水華問題,徹底解決滸苔大爆發(fā)的問題還應(yīng)該以預(yù)防為主,減少對海水的污染,控制海水的富營養(yǎng)化。

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