脫水對條斑紫菜葉狀體psbA和psbD基因表達量的影響

楊 芳,王廣策,張寶玉,陳張帆,潘光華

(1.天津科技大學,天津 300457;2.中國科學院 海洋研究所,山東 青島 266071)

潮間帶是指大潮高潮線與大潮低潮線之間的海岸帶,是由海洋向陸地過渡的中間地帶。該地區在高潮時被海水淹沒,具有一定的海洋環境特性;低潮時露出,又具有一定的陸地環境特性,因此潮間帶是研究生物由海洋進化到陸地的關鍵區域。除了潮水漲落的變化外,潮間帶地區的鹽度、光照、溫度等其他環境因子水平的變化幅度也很大。在這種海陸交替的特殊地區生存著許多具有特殊生活習性的物種,構成了獨特的生態系統。這些生物不僅適應了潮漲潮落,對周期性的脫水和復水具有很好的耐受力,對環境因子水平的大尺度周期性變化也具有很強的適應性。

紫菜是重要的潮間帶大型紅藻。因含有較高含量的蛋白質、礦物質、碳水化合物和膳食纖維,紫菜早已成為人類的食物[1];紫菜養殖業在中國、日本、韓國等國家也已經成為大規模的大型海藻產業之一。條斑紫菜(Porphyra yezoensisUeda)是紫菜屬中的重要物種,主要生長在太平洋西北部包括中國東部沿岸在內的大部分地區,日本和韓國沿岸[2]。研究表明條斑紫菜具有耐干出的特點,暴露在空氣中幾天仍然能夠在海水中完全恢復[3]。利用條斑紫菜的耐干出特點,將其在空氣中人工干出已經成為條斑紫菜養殖和保種的重要應用技術之一。條斑紫菜的半浮筏式養殖法就是讓附著在養殖網上的紫菜隨潮汐漲落經歷脫水(干出)復水過程。這種養殖方法很適合在潮汐落差較大的潮間帶[2]。海水養殖業的經驗證明,在空氣中適當干出藻體可以增強藻體對病害的抵御能力,去除競爭性雜藻,如硅藻,從而提高紫菜的質量和產量[2]。此外,傳統的保存條斑紫菜葉狀體的方法是將紫菜放在陰涼處迅速晾干置于-20℃保存,這種保存方法在發展中國家仍然很常用。如果將藻體脫水至含水量 20%左右,藻體可以保存將近 12個月[2]。由此可見,條斑紫菜的養殖和保種都得益于其耐干出特性,這使得研究脫水對條斑紫菜的影響意義重大。

光合作用受到多種環境因子的影響,其中影響最大的因素就是水分[4]。因此,很多人研究了潮間帶大型海藻在脫水過程中的光合活性的變化。研究發現一些潮間帶大型海藻在適度脫水時光合速率會顯著增強[3,5-8];而腹枝藻[9],壇紫菜[10]和半葉紫菜[4]在適度脫水過程中則沒有光合速率增大的現象。但是,這些研究多是停留在生理水平上,很少有報道涉及大型海藻在脫水過程中的分子水平的變化機制。條斑紫菜作為光能自養型生物,其光合作用對水分變化十分敏感,但是其又具有脫水數小時后遇水能快速恢復的特性,并且這種特性被廣泛應用于條斑紫菜的養殖和保種業中。因此,在分子水平上研究條斑紫菜光合作用的相關蛋白對脫水復水的響應機制具有十分重要的意義。

葉綠體是進行光合作用非常重要的細胞器。條斑紫菜的葉綠體為星狀,很不規則,從進化的角度上說屬于很低等的[11]。在條斑紫菜葉綠體內的類囊體膜上鑲嵌有光系統 I ( PSⅠ) 和光系統Ⅱ( PSⅡ)蛋白復合體。PSⅡ的反應中心是反應中心蛋白結合P680、去鎂葉綠素等電子傳遞體的復合物,該復合物將電子由PSⅡ傳遞給PSⅠ,從而完成光合作用重要步驟[12]。PSⅡ的D1 和D2兩個反應中心蛋白分別由葉綠體基因psbA 和psbD編碼。因此,研究藻類的psbA 和psbD基因對研究其光合作用具有重要意義。對于條斑紫菜,陳張帆等人研究了其不同生長階段——殼孢子、孢子體和葉狀體,psbA 和psbD基因轉錄水平的不同,結果表明不同階段的條斑紫菜psbA 和psbD轉錄水平上的相對表達量不同,認為殼孢子發育成葉狀體的過程需要光合作用提供能量[13]。而有關條斑紫菜的psbA 和psbD在脫水復水過程中表達量的變化尚未見報道。

本實驗選取處于不同脫水和復水階段的條斑紫菜葉狀體為材料,對其psbA和psbD轉錄水平上的相對表達量進行研究,以探討組裝 PSⅡ的中心蛋白(D1,D2蛋白)的基因在條斑紫菜處于不同脫水復水階段時的變化。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及制備

條斑紫菜葉狀體于 4月份采于青島第一海水浴場,用滅菌海水沖洗干凈。吸干藻體表面可見水珠,稱取適量藻體于密閉塑料袋中,-80℃冰箱保存,作為相對含水量為100%的實驗材料。將剩余藻體進行陰干處理,讓其于實驗室條件下自然脫水 15 min、60 min和105 min,分別于密閉塑料袋中-80℃冰箱保存。剩余藻體進行復水30 min處理后于密閉塑料袋中-80℃冰箱保存。

1.2 樣品相對含水量的測定及定量PCR分析

1.2.1 條斑紫菜體葉狀體相對含水量測定

相對含水量測定方法：吸干藻體表面可見水珠,用分析天平稱初始質量。與1.1.2同種處理方法對藻體進行脫水處理,每15 min測定1次藻體質量。最后 1次稱質量后,將藻體置于 60℃烘箱中,烘干至恒質量(約48 h),作為藻體干質量,并計算相對含水量(3個平行樣)。

相對含水率(RWC)計算公式：

其中,W0為初始質量(g),Wt為特定時間藻體質量(g),Wd為藻體干質量(60℃,48 h)。

1.2.2 總RNA提取

將100 mg條斑紫菜葉狀體樣品分別于液氮中充分研磨至粉末狀,轉移到 1.5 mL離心管中。加入1 mL Trizol(Invitrogen)試劑混勻,室溫放置5 min。13 000g,4℃,離心1 0 min。取上清移至新離心管中。加入200 μL預冷的氯仿,振蕩15 s,室溫下靜置2～3 min。13000g,4℃,離心15 min。取上清移至新離心管中。加入500 μL預冷的異丙醇,于-20℃冰箱中靜置 20～30 min。13 000g,4℃,離心 10 min。棄上清,沉淀中加入1 mL 預冷的75%乙醇洗滌沉淀。10 000g,4℃,離心5 min。棄上清,于超凈工作臺中風干 5 min。加入適量的 DEPC水溶解 RNA,于-80℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質量。

1.2.3 總RNA中微量DNA的去除

提取的總 RNA中加入 RQ1 Rnase-Free Dnase(Promega),37℃,30 min消化DNA。加入4 μL Stop Solution,65℃反應10 min,終止消化反應。

1.2.4 cDNA合成

根據 M-MLV 逆轉錄酶(Promega)的說明書,在新的離心管中加入隨機引物(100μmol/L)2.7 μL,消化好的RNA模板10.65 μL。70℃,變性5 min。轉移到冰上冷卻 2 min。在離心管中加入：M-MLV 5?Reaction Buffer 5μL,dNTP mix(10 mmol/L)5 μL,RNase Inhibitor 0.65 μL,M-MLV RT 1μL。36℃,反轉錄60 min。稀釋1 000倍作為熒光定量PCR的模板,于-20℃保存待用。

1.2.5 熒光定量PCR

熒光定量PCR所用引物及反應條件引用陳張帆的實驗方法[13],引物由上海生工合成。每個樣品均重復3管,設空白對照。

1.2.6 數據分析

根據△△CT法[14]分析數據。計算psbA和psbD的相對表達量的差異,采用t檢驗方法進行兩兩比較以判斷有無顯著差異。

2 結果

2.1 條斑紫菜葉狀體相對含水量測定結果

在條斑紫菜干出過程中每隔15 min測定一次材料的質量,計算出實驗所用條斑紫菜葉狀體的相對含水量,并擬合出相對含水量與材料脫水時間的關系曲線。根據所得數據可以確定條斑紫菜在未脫水,脫水15 min、60 min和105 min時藻體的相對含水量分別約為100%、71%、34%和21%。

2.2 樣品總RNA的檢測

獲得的樣品的總 RNA在電泳圖譜(圖1)中出現28S,18S rRNA清晰的電泳帶,1,2,3,4,5所對應的條帶從下到上分別為5S,18S,28S rRNA。本研究使用的總RNA含量較高,純度好且無降解。

圖1 條斑紫菜總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA extracted from Porphyra yezoensis with various relative water content (RWC) of rehydration

2.3 psbA、psbD相對表達量的變化

如圖2所示,psbA、psbD基因在脫水過程中相對表達量呈先增大后減小的趨勢,并且psbA基因的相對表達量的變化幅度比psbD基因要大。在含水量約為 71%時兩基因的相對表達量均達到最大,此時,psbA基因的相對表達量是正常狀態(相對含水量100%)下該基因的相對表達量的 7.18倍(P <0.01);psbD基因的相對表達量是正常狀態下該基因的相對表達量的3.13倍(P <0.01);psbA基因的相對表達量是psbD基因的相對表達量的2.29倍(P <0.05)。進一步脫水的過程中,兩個基因的相對表達量都降低,當含水量達到21%時兩基因的相對表達量基本持平,且都比正常狀態下的相對表達量低(P <0.01)。復水后,psbA基因的相對表達量是正常狀態下的0.68倍(P <0.01);psbD基因的相對表達量是正常狀態下的0.30倍(P <0.01);此時,psbA基因的相對表達量是psbD基因的相對表達量的2.25倍(P <0.01)。

圖2 Real-time PCR檢測不同脫水復水階段的條斑紫菜細胞中psbA, psbD基因的轉錄水平上相對表達量的變化Fig.2 Variations in psbA and psbD transcript levels using real-time PCR.Total RNA was isolated from samples with various relative water content (RWC) of rehydration

3 討論

條斑紫菜葉狀體中具有很高的多糖和蛋白含量,這給提取純度較高質量較好的RNA帶來了困難。本研究通過Trizol法得到了條斑紫菜葉狀體的總RNA中18S和28S rRNA,其電泳條帶都較清晰且沒有拖尾降解現象,表明通過這種方法提取的RNA質量較好。熒光定量PCR技術是一種可以檢測低豐度基因表達的技術。本實驗中使用能非特異性地滲入DNA雙鏈中發生熒光信號的SYBR Green染料,因此在實驗中要避免產生非特異性擴增與引物二聚體。所采用的三對特異性引物(psbA、psbD和18S rRNA的引物)均使用陳張帆[13]已被證實的引物。實驗數據處理上采用了相對定量法,有效降低了各種誤差。

有關缺水對高等植物光合作用影響的研究已經比較深入。早期有研究表明,PSⅡ對脫水甚至是輕微脫水都很敏感,嚴重時會發生損傷[15]。但也有研究指出,PSⅡ甚至整個光合作用復合體可以積極抵御缺水脅迫[16-17]。對于高等植物在水分脅迫下的psbA、psbD表達量的變化已有人研究。劉文娟等人對兩種小麥品種綿農4號和5號的研究表明水分脅迫下,兩種小麥的 PSⅡ主要基因(psbA、psbD)的轉錄水平下降[18];Yuan Shu等[19]對大麥的研究結果也表明水分脅迫下,大麥的 PSⅡ主要基因(psbA、psbD)的轉錄水平會下降;He等[20]的研究結果表明,小麥(Triticum aestivumL.cv.Longchun No.10)的psbA、psbD在缺水情況下表達量降低是由于轉錄水平降低或者mRNA 的穩定性降低;Collett等[21]發現Xerophyta humilis的psbR,ChlP,psbA和psbP基因在該植物脫水過程中分別呈現不同程度的轉錄水平上的表達量下降趨勢;Zhang等[22]的研究結果則表明沙漠植物Ammopiptanthus mongolicus在缺水的情況下的cab基因會下調,但是psbA基因則沒有很大變化。對于高等植物缺水狀態下的光合作用的分子變化機制的研究不僅局限于此,但是有關潮間帶大型海藻對脫水的研究卻多在生理水平上,幾乎沒有深入到分子水平的相關研究。

本實驗用熒光定量PCR技術檢測了條斑紫菜葉狀體不同脫水復水階段中的psbA 基因(編碼 D1)和psbD基因(編碼D2)在轉錄水平上的相對表達量的變化。選用脫水15 min,60 min,105 min(即對應相對含水量為71%,34%,21%)分別代表輕微脫水、中度脫水和嚴重脫水 3個階段。結果表明在輕微脫水狀態下,psbA、psbD相對于18S rRNA (管家基因)的表達量呈現先增大后降低的趨勢(圖2)。這個研究結果與高等植物在脫水過程中的相應研究結果相差甚遠,但是恰恰與之前本組實驗人員通過調制葉綠素熒光儀研究的條斑紫菜在脫水過程中PSⅡ活性的變化趨勢相一致：即 PSⅡ活性在藻體輕度脫水狀態下反而比正常狀態下的略有升高,并且隨著脫水程度的加劇,其活性逐漸降低至接近于零(未發表資料)。根據這些實驗結果推測：由于條斑紫菜在輕度脫水時僅是藻體細胞表層水分蒸發,使藻體細胞能夠更好的接觸到空氣中較多的 CO2,導致藻體本身需要更多的化學能來固定碳,因此形成反饋調節。為促使光反應增強,編碼PSⅡ的中心蛋白的psbA、psbD基因會表現出較高的轉錄水平以滿足其需求,從而導致了PSⅡ的活性出現暫時增強的現象。由此,作者推斷在輕度脫水狀態下psbA和psbD基因轉錄水平上的相對表達量的快速增大可能是藻體暴露在空氣中時適應陸地環境的初始響應。而隨著脫水程度的加劇,細胞本身水分揮發,沒有足夠的水進行正常的生命活動,光合作用的光化學反應也沒有足夠的水以備裂解。表現為 PSⅡ的活性迅速降低,藻體本身不再需要大量的PSⅡ中心蛋白。因此,psbA、psbD基因會有較低的轉錄水平以減少物質消耗而處于光合作用減弱甚至是休眠狀態。

然而,在測定PSⅡ的中心蛋白D1、D2的mRNA分子表達水平的變化時發現,雖然psbA、psbD的相對表達量都呈現相同的變化趨勢,但增大的幅度卻相差很大(圖2)。Kapoor等[23]在水稻的生長發育過程中也發現,雖然psbA和psbD基因的表達均增大,但是它們的增大倍數不同。這與本研究的結果一致,表明雖然D1蛋白和D2蛋白在PSⅡ反應中心復合物中以同比例裝配,但是psbA和psbD基因的mRNA水平上的表達量變化幅度并不同步。此外,有關D1蛋白的研究表明,D1蛋白暴露于強光下或處于強光與環境脅迫相偶聯的環境時,其降解速率就會超過合成速率[24-25]。類囊體膜發生損傷時,D1蛋白開始周轉,同時 PSⅡ伴隨著新合成的 D1蛋白的合成重新組裝。對藍藻Synechocystissp.PCC6803的研究表明,對蛋白合成過程中的表達步驟的控制是在高光強下PSⅡ光抑制的主要原因[26],而psbA基因的 mRNA的翻譯是D1蛋白合成的關鍵調控步驟[27-28],這使得研究psbA基因 mRNA的表達量具有更重要意義。條斑紫菜脫水過程中psbA基因轉錄水平上的相對表達量高于psbD基因,可能是由于脫水過程導致 D1蛋白快速周轉,因此需要大量的psbA基因的mRNA來支持D1蛋白的快速周轉。同時說明,對于不同的psbA和psbD基因的mRNA水平的相對表達量而言,二者的有效翻譯率或組裝率必定不同。

另外,有研究表明 Dl蛋白的合成還受 PSⅡ中其他蛋白質協同表達的影響。在缺失psbD的Chlamydomonas reinhardtii中,盡管 D1蛋白的mRNA含量正常,但由于D2蛋白不能被合成,因此Dl蛋白也不存在[29];反之,在psbA失活的Syneehocystis6803的突變體中,Dl蛋白不能形成,D2蛋白也不積累[30]。即真正組裝的PSⅡ的中心蛋白的量是由相對含量較少的蛋白決定的。本實驗中,雖然在輕度(RWC 71%)和中度(RWC 34%)脫水狀態下psbA基因的相對表達量是psbD基因的相對表達量的2.29倍(P <0.05)和5倍(P <0.01),但psbD基因的相對表達量較低,因此認為真正組裝的 PSⅡ的中心蛋白的量不是由psbA基因的mRNA決定,而是由psbD基因的 mRNA決定。有關引起psbA和psbD基因的表達量變化趨勢不一致的原因還有待進一步研究。

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