山羊瘤胃內產乳酸菌的分離鑒定及其產 D-、L-乳酸特性的研究

魏德泳 朱偉云 毛勝勇

(南京農業大學消化道微生物研究室,南京 210095)

乳酸是瘤胃內一類重要的中間產物,大多瘤胃微生物如牛鏈球菌和乳酸桿菌均可發酵谷物類飼料并產生乳酸,而乳酸利用菌如埃氏巨球型菌等則可利用乳酸生成丙酸,因此,維持較低水平的乳酸對維持乳酸利用菌的數量和瘤胃正常生理功能具有積極的意義。同時,適當濃度的乳酸還有利于減輕瘤胃內硝酸鹽的毒理效應[1]。但當動物飼糧突然從青粗飼料轉變成高谷物飼料時,瘤胃內乳酸濃度會顯著升高,瘤胃 pH持續下降,導致乳酸利用菌的生長被抑制,乳酸產生菌群和利用菌群之間正常的平衡受破壞,大量乳酸會在瘤胃中累積,導致 pH進一步降低,從而引發瘤胃急性酸中毒。在瘤胃中,微生物產生的乳酸有 D-和L-乳酸之分,動物機體組織中含有大量能氧化L-乳酸的酶,而 D-乳酸必須經過體組織內線粒體膜才能被氧化,因此,D-乳酸降解慢,其毒性更大。推測D-乳酸可能是造成瘤胃急性酸中毒和宿主代謝性酸中毒的根本原因[2-3]。但瘤胃中到底哪些微生物是主要的 D-、L-乳酸產生菌,目前相關報道極少。在我國,隨著近年來牛羊養殖業的快速發展,發生瘤胃酸中毒的報道也不斷增多。為了解我國本土動物瘤胃內產乳酸菌的種類,闡明其產 D-、L-乳酸的特性,本試驗利用本地山羊,從瘤胃中分離獲取主要的乳酸菌,在此基礎上研究其產 D-、L-乳酸的能力,為進一步認識這些微生物在瘤胃消化中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗動物選擇 3頭裝有永久性瘤胃瘺管的體況良好的雄性長江三角洲白山羊。飼糧精粗比例為 6∶4,預試期 2周。第 1周將山羊的飼糧精料添加量從 200 g/d逐漸增加到 400 g/d,飼糧精料由70%玉米和 30%豆粕組成,自由采食羊草;第 2周精料添加量保持為 400 g/d,自由采食羊草。

1.2 培養基成分及其配制

乳酸菌瓊脂培養基(MRS)組成：蛋白胨 10 g,牛肉浸膏 10 g,酵母浸膏 5 g,葡萄糖 20 g,檸檬酸三銨2 g,CH3COONa 5 g,K2HPO45 g,M gSO4?7H2O 0.5 g,MnSO4? 4H2O 0.2 g,吐溫 -80 1 g,瓊脂粉 15 g,加蒸餾水至 1 L,調節pH至 5.5～6.2,115℃高溫滅菌 15 min,待培養基的溫度降至 60℃后制備平板備用。

1.3 產乳酸菌的富集與分離純化

在預飼 2周后,采集 3頭山羊的混合瘤胃內容物,并保存于保溫瓶內。瘤胃液經過 4層紗布過濾去除固相,取 1m L瘤胃液接種至10m LMRS液體厭氧培養基內,39℃富集培養。間隔 24 h以1%(V/V)的接種量傳代 1次,連續傳代 5次。取第 5代培養物 0.1 m L進行 10倍梯度稀釋,取 3個梯度的樣品 0.1 m L涂布于 MRS平板培養基上,置于厭氧工作站培養 48 h后,在菌落密度合適的平板上挑取形態、顏色等不同的菌落,繼續劃線培養至菌落形態單一。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 形態特征觀察

菌體經稀釋后涂布于平板上,于厭氧工作站中 39℃培養,48 h后觀察菌落形態。

1.4.2 生理生化特性鑒定

生理生化特性鑒定方法參考東秀珠等[4]的方法進行,所用微量發酵管購自浙江杭州天和微生物試劑有限公司。

1.4.3 分離菌株 DNA提取、PCR擴增及16S rRNA基因序列測定及系統發育分析

各菌株體外培養 24 h后,收集菌體,用于DNA的提取,DNA提取和 16S rRNA序列擴增方法分別參照 Murray等[5]和 Zoetendal等[6]的方法進行。所用細菌 16S rRNA全長通用引物序列如下：上游引物 8f[5′CACGGATCCAGAGTTTGAT(C/T)(A/C)TGGCTCAG 3′],下游引物 1510r(5′GTGAAGCTTACGGCTACCTTGTTACGACTT 3′)。PCR反應程序為：94℃ 3 min,而后 94℃30 s,52℃30 s,68℃ 1.5 m in,30個循環,68℃最終延伸 7 min。PCR產物經 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,片段長度正確的 PCR產物送至南京丁貝生物技術有限公司測序。本試驗所測菌株 16S rRNA基因序列在 GenBank的登錄號分別為HQ452822、 HQ452821、 HQ452823、 HQ452824、HQ452825、HQ452826。從 GenBank中獲取與之有較高同源性的模式菌株的 16S rRNA基因序列。采用 Clustalx(1.81)和 MEGA(4.0)軟件進行系統發育分析,利用鄰接(neighbor-joining)法建立系統進化樹。

1.5 生長曲線與 D-、L-乳酸的測定

取 1m L復壯的分離菌株置于 9m L的 MRS液體厭氧培養基中,以不接種培養基為對照,每間隔 2 h測定接種試管中培養液的吸光度(OD)值,測定波長為 600 nm,繪制各產乳酸菌生長曲線。采用試劑盒(購自上海必優公司)測定培養 24 h后各菌株發酵液中 D-、L-乳酸濃度。

1.6 數據統計

采用 SPSS 18.0軟件包中的 One-way ANOVA進行單因素分析,均值的多重比較采用 Duncan氏法進行,以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 菌株分離與形態學特征

利用涂板劃線分離技術,盡可能挑取菌落形態、顏色不相同的細菌,經連續分離純化,最終獲得 6株乳酸產生菌,分別命名為 L2、L3、L5、L8、L10和 L12。革蘭氏染色鑒定表明,L2、L5、L8和L10為革蘭氏陰性菌;L3和 L12為革蘭氏陽性菌。形態學觀察表明,L2、L5、L8和 L10的形態相近,單個細菌呈球狀或橢圓狀,多聚集在一起,成鏈狀;L3和 L12的形態相近,呈短桿狀或橢圓形,皆比較濕潤,有光澤,光滑,邊緣整齊。

2.2 分離菌株的生化特征

各菌株的生化特征如表 1所示。L8和 L10菌株可利用木糖、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖和乳糖,但不能利用葡萄酸鹽和山梨醇;L3和 L12菌株能利用纖維二糖、果糖、葡萄糖、乳糖、葡萄酸鹽、麥芽糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖、阿拉伯糖和山梨醇,但不能利用木糖、七葉靈、半乳糖和核糖;L2菌株可利用木糖、纖維二糖 、七葉靈 、半乳糖 、葡萄糖、乳糖、麥芽糖 、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖和阿拉伯糖,但不能利用葡萄酸鹽、山梨醇和核糖;L5菌株可利用木糖、纖維二糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、松三糖、蜜二糖、鼠李糖、水楊苷、蔗糖和阿拉伯糖,但不能利用七葉靈、葡萄酸鹽和山梨醇。

表 1 生化鑒定結果Table 1 The results of biochem ical identification

2.2.3 菌株 16S rRNA基因系統發育分析

由表 2可見,L2、L8、L10與牛鏈球菌(Streptococcus bovis)的 16S rRNA的相似性達 99%,L5與馬鏈球菌(Streptococcus equinus)相似性高達99%,L3、L12與食竇魏斯氏菌(Weissella cibaria)相似性達 99%。系統發育分析結果表明,L2、L8、L10和 L 5位于同一簇群內,屬鏈球菌屬;而 L3與L12位于另一簇群內,屬魏斯氏菌屬。

表 2 分離菌株 16S rRNA基因序列與 Genbank已知菌序列的相似性比較Table 2 Comparison of sim ilarity o f 16S rRNA gene sequence in iso lated strains with know n species in GenBank

2.3 生長曲線

各分離菌株生長曲線結果顯示,除 L2與L12,其余 4株乳酸產生菌均在接種后 2 h左右進入對數生長期,L5和 L10菌株在接種后 8 h左右進入平臺期,其余菌株在接種后 10 h左右入平臺期。

2.4 菌株產 D-、L-乳酸的測定

由表 3可見,6株產乳酸菌中,L2產 L-乳酸量最高,顯著高于其他各組(P＜0.01),其他菌株產 L-乳酸量均達到 14 mmol/L以上。L3、L5和L12產 D-乳酸產量較高,達 14mmol/L以上,而L2、L8和 L10菌株產 D-乳酸量較低,其中 L8產D-乳酸量最低,僅 0.083mmol/L。

圖 1 分離菌株的 16S rRNA基因系統發育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA gene sequence of isolates

圖 2 各菌株生長曲線Fig.2 The grow th curves o f the isolated strains

3 討 論

反芻動物瘤胃微生物在飼糧降解過程中起著重要作用,當飼糧中精料比例較高時,瘤胃中主要產乳酸菌包括牛鏈球菌、馬鏈球菌、乳桿菌、棲瘤胃擬桿菌和雙岐桿菌,其中牛鏈球菌最為常見。據報道,在全牧草飼糧條件下,瘤胃中牛鏈球菌數量在 104～107CFU/g,但在以谷物類飼糧為主時,其數量可達到 1011CFU/g,而這主要歸因于鏈球菌具有較其他瘤胃微生物更快的生長速度[7]。本研究分離到的6株產乳酸菌中,3株為牛鏈球菌屬,從生長曲線結果可見,3株鏈球菌的生長速度很快,在 10 h內全部進入平臺期,說明在以葡萄糖等單糖為底物的條件下,這些菌具有較快的生長速度,是山羊瘤胃中的優勢產乳酸菌。馬鏈球菌也是一類常見于動物消化道內的重要腸道菌,該菌可發酵淀粉類多糖生成乳酸,本研究從山羊瘤胃中分離獲得 1株馬鏈球菌,結果也進一步證實牛鏈球菌與馬鏈球菌是瘤胃中 2類主要的乳酸產生菌。魏斯氏菌屬(Weissella)是一類廣泛分布于發酵食物(如臘腸、泡菜)、土壤等環境中的微生物,屬乳酸菌群(lactic acid bacteria),與乳酸桿菌(Lactobacillus)十分相似,通過形態及生化鑒定很難將其完全區分。據報道,目前該屬中僅見分離于人類或其他動物的融合魏斯菌、食物魏斯菌,尚無在反芻動物瘤胃中分離獲得食竇魏斯氏菌的報道[8]。本試驗首次從瘤胃中分離到 2株食竇魏斯氏菌,生長曲線結果顯示這 2株菌也具有較高的生長速度,在接種后 10 h內進入平臺期。此外,其產 L-與 D-乳酸的都量很高,此結果也說明該菌株可能是山羊瘤胃中另一類主要的產乳酸菌。

表 3 分離菌株產 D-、L-乳酸濃度Tab le 3 Concentrations o f D-and L-lactate p roduced by iso lated strains mmol/L

乳酸桿菌是一類常見于單胃動物胃腸道中的產乳酸菌,但其在反芻動物瘤胃中數量不高,在本研究中我們未分離到乳酸桿菌。據報道,乳酸桿菌僅在瘤胃 pH低于 4.5時才成為主要的優勢菌,而在亞臨床酸中毒時,瘤胃中主要的產乳酸菌為牛鏈球菌[9-10]。在本研究中,所用試驗動物未達到瘤胃酸中毒狀態。結果說明,在常規補飼精料情況下,瘤胃中主要的可培養產乳酸菌可能為牛鏈球菌、馬鏈球菌和食竇魏斯氏菌。

如前言所述,瘤胃微生物發酵所產乳酸主要包括 L-與 D-乳酸,其中 L-乳酸可被埃氏巨球菌、棲瘤胃擬桿菌等利用生成揮發性脂肪酸,而D-乳酸難以被直接代謝,因此 D-乳酸可能是導致瘤胃 pH下降的主要原因之一。本研究發現,所分離 6株細菌中,食竇魏斯氏菌產D-乳酸的量最高,而所分離的鏈球菌中,僅 L5所產 D-乳酸量達到 14 mmol/L,結果說明,食竇魏斯氏菌可能是瘤胃中主要的產 D-乳酸的微生物,但由于該菌是首次在瘤胃中分離獲得,有關該菌在瘤胃中具體分布及功能情況尚不清楚,待進一步研究。

4 結 論

綜上可知,本試驗從山羊瘤胃中分離獲得 6株產乳酸菌,生化與分子鑒定結果均表明山羊瘤胃中主要的產乳酸菌是牛鏈球菌、馬鏈球菌與食竇魏斯氏菌,且以產混合型乳酸為主。

[1] IWAMOTO M,ASANUMA N,HINO T.Effects o f energy substrates on nitrate reduction and nitrate reductase activity in a rum inal bacterium,Selenomonas rum inantium[J].Anaerobe,2001,7(6)：315-321.

[2] MARCILLAUD S,SCHELCHER F,BRAUN J P.D-lactic acid and D-lactic acidosis in humans and domestic animals：a review[J].Revue de Médecine Vétérinaire,1999,150(3)：233-240.

[3] LORENZ I.D-lactic acidosis in calves[J].The Veterinary Journal,2009,197(2)：197-203.

[4] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社,2001：399-412.

[5] MURRAY A E,PRESTON C M,MASSAWA R,et al.Seasonal and spatial variability of bacterial and archaeal assemblages in the coastal waters near Anvers Island,Antarctica[J].App lied and Environmental M icrobiology,1998,64：2585-2595.

[6] ZOETENDAL E G,AKKERMANS A D L,DE VOSW M.Temperature gradient gel electrophoresis analysis from human fecal sam ples reveals stable and host-specific comm unities of active bacteria[J].Applied and Environmental M icrobiology,1998,64：3854-3859.

[7] NAGARAJA TG,TITGEMEYER E C.Rum inalacidosis in beef cattle：the current m icrobio logical and nutritional outlook[J].Journal of Dairy Science.2007,90(1)：17-38.

[8] 李中華,段雄波,李金鐘.魏斯菌屬細菌的分類與鑒定新進展[J].國際檢驗醫學雜志,2006,27(8)：721-723.

[9] OWENS F N,SECRIST D S,HILL W J,etal.A cidosis in cattle：a review[J].Journal of Animal Science,1998,76：275-286.

[10] 王麗娟,劉大程,盧德勛,等.日糧同時添加酵母培養物與延胡索酸二鈉與對慢性酸中毒奶山羊瘤胃發酵和細菌數量的影響[J].動物營養學報,2009,21(1)：67-71.