不同預處理方法對剩余污泥厭氧發酵產氫的影響

李建政，昌 盛，劉 楓

(哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室，150090哈爾濱，ljz6677@163.com)

發酵法生物制氫，能以可再生的生物質，甚至是富含生物質的廢水、垃圾或禽畜排泄物為原料［1-5］，在清潔能源生產、廢物資源化和環境保護等方面均顯示出重要意義，展現出較好的發展前景［3，6-7］.以混合菌群(活性污泥)為基礎的發酵法生物制氫技術，其基本原理是產酸發酵細菌將有機物分解為有機酸(乙酸、丁酸)和乙醇等產物的同時，釋放H2和CO2［7］.大量研究表明，生物發酵制氫的種泥來源十分豐富，農田土壤、城市污水處理廠的好氧污泥和消化污泥、市政排水管網下水道的底泥以及厭氧生物處理反應器中的污泥均可作為產氫菌種來啟動制氫反應器［8］.然而，這些污泥中的微生物種類繁多，常有耗氫菌的存在，如產甲烷菌和同型產乙酸菌等，它們的耗氫行為，不可避免地會降低發酵系統的產氫效能和延長反應器的啟動時間［9-13］.為了最大程度地提高接種污泥中產氫菌的數量和活性，將耗氫菌的數量降到最低，縮短反應器啟動周期，國內外研究中對接種至生物制氫反應器的污泥采用了多種方法進行預處理，但由于選用的種泥以及具體的處理條件不同，得出的結論各異，有的研究認為熱處理最為合適［14-15］，有的認為酸處理最為有效［16-17］，對各種預處理方法進行全面對比分析的報道還較少［15］.本文以最易獲得的城市污水處理廠好氧活性污泥為對象，通過間歇發酵試驗，對比分析了種泥經酸、堿、熱、曝氣、氯仿——CHCl3和二溴乙烷磺酸鈉——BES等6種預處理方法處理后的產氫性能和發酵特性，以篩選出最為合適有效的預處理方法，尋求產氫菌的富集方法，為連續流生物制氫反應器的快速啟動以及提高系統的產氫效能提供指導.

1 試驗

1.1 種泥來源與預處理方法

試驗采用的種泥取自哈爾濱市太平污水處理廠二沉池排放的剩余污泥，取得污泥后，經淘洗過濾，去除污泥中的大顆粒物，沉淀0.5 h，去上清液后使用，其 MLSS、MLVSS分別為 20.35和14.43 g/L.取混勻污泥50 mL 8份，分別置于7個100 mL的燒杯中，按以下順序進行各種預處理:①酸處理:用4 mol/L的HCl將污泥pH值調節為3，在攪拌下維持pH值穩定5 min后，靜置24 h;②堿處理:用6 mol/L的NaOH將污泥pH值調節為10，在攪拌下維持pH值穩定5 min后，靜置24 h;③熱處理:在100℃的水浴鍋中恒溫加熱處理30 min;④曝氣處理:以500 mg/L的質量濃度加入葡萄糖，曝氣培養24 h;⑤CHCl3處理:以0.1%的體積分數加入CHCl3溶液，磁力攪拌機下攪拌1 h后，靜置24 h;⑥BES處理:以10 mmol/L的濃度加入一定質量的BES，磁力攪拌機下攪拌1 h后，靜置24 h;⑦第7個燒杯中未經過預處理的污泥作為空白對照.

1.2 培養方法

間歇發酵反應器采用容積為296 mL的血清瓶.裝瓶方法為:每只滅菌血清瓶移入85 mL培養液后，用無菌注射器以15 mL的劑量接種經不同方法預處理過的污泥或未經處理的對照污泥(反應體系中的污泥濃度(MLVSS)約為2 g/L)，并用1 mol/L的NaOH和HCl溶液將混合液的初始pH調為7.0;充高純氮氣5 min，膠塞密封.接種完成后的反應體系，總體積為100 mL，營養組分如下(g/L):C6H12O6·6H2O 10.0;NH4C1 0.5; KH2PO40.5;K2HPO40.5;NaHCO34.0;MgC12· 6H2O 0.2;ZnSO4·7H2O 0.01;MnC12·4H2O 0.03;H3BO30.03;CoC12·6H2O 0.02;CaCl2· 2H2O 0.01;NiCl2·6H2O 0.02;Na2MoO4·2H2O 0.03;FeC12·4H2O 0.15.將密封后的血清瓶置于恒溫空氣浴振蕩器中，在150 r/min下35℃恒溫培養30 h.對照污泥和各預處理后的污泥樣品的培養，均采用3只培養瓶平行進行，相關分析數據取3個平行反應系統平均值.

1.3 分析方法

pH、MLSS和MLVSS采用國家標準方法測定［18］，葡萄糖測定采用DNS法［19］.發酵產氣量采用10～100 mL的玻璃注射器定時排氣計量，并折算為標準狀態(0℃，101.325 kPa)體積數;發酵氣組分采用氣相色譜儀進行分析［20］，累積產氫量參照Owen法進行計量［21］.以無菌注射器定時從反應瓶中抽取反應液1.5 mL，6 000 r/min離心，取上清液0.5 mL 2份，分別用于葡萄糖質量濃度和液相末端發酵產物(VFAs和乙醇)的分析.其中，VFAs和乙醇的分析采用另一臺氣相色譜儀測定［20］.

2 結果與討論

2.1 產氫量

在42 h的發酵反應過程中，對照樣品及其他經過預處理的污泥樣品的反應體系中，所產生的生物氣中只含有H2和CO2，均未檢出CH4.然而，在Hu和Chen的研究中，未經處理的污泥在降解糖類發酵產氫時，有CH4存在，造成這種差異原因可能是本文的接種污泥來源于城市污水處理廠的二沉池，污泥中的微生物以好氧和兼性菌種為主，僅含有少量甲烷甚至不含有產甲烷菌種，所以，本文的研究中，未經處理的污泥進行發酵產氫時，未檢測到CH4.圖1顯示了不同預處理方法對累積產氫量的影響，在發酵反應進行到24 h時，各發酵體系的累積產氫量達到最大值，分別為31.81(對照)、169.95(酸)、144.43(堿)、100.25 (熱)、72.98(曝 氣)、51.24(CHCl3)、28.32(BES)mL.發酵產氫反應進行到24 h之后，各發酵體系的累積產氫量都有一定量的下降，但并未檢出CH4.這一現象說明，系統中存在著除甲烷以外的其他耗氫菌群，這與Bita和Yu等所報道的結果相似［14，22］.

圖1 不同預處理方法下的累積氫氣產量

式中:H為累計產氫量(mL)，Pmax為最大產氫量(mL);Rmax為最大產氫速率(mL/h)，λ為延滯時間(h).

利用Origin 8.0軟件進行擬合的結果見表1，改進的Gompertz模型比較適合于描述反應過程中累積產氫量的變化，復相關系數 R2均大于0.99.除了經過BES預處理的污泥樣品外，其他經過預處理后的污泥樣品對葡萄糖進行發酵獲得的最大產氫量(Pmax)和最大產氫速率(Rmax)都遠大于未處理的污泥.據文獻報道［15，17］，對糖類進行厭氧發酵能代謝產氫的微生物主要以梭菌屬為了解發酵系統產氫的動力學特征，采用改進的Gompertz模型(式(1))對得到的累積產氫曲線進行了非線性擬合［23］:高和腸細菌為主，由于梭菌屬在極端環境下，如溫、強酸、強堿和化學藥物抑制劑下，能形成芽孢，具有自我保護功能.還有研究表明［15］，大部分梭菌屬和腸細菌能在少量氧氣存在下存活.而產甲烷和同型產乙酸菌等則屬于嚴格的厭氧菌屬，當有氧氣存在時將失去活性.于是，當污泥經過預處理后，相對于產甲烷和同型產乙酸菌種來講，梭菌屬和腸細菌仍得以存活下來的幾率要更大.因此，對污泥采用合適的預處理方法，在抑制產甲烷和同型產乙酸等耗氫菌群的同時，保持了產氫菌的活性，提高了發酵系統的最大產氫量和最大產氫速率.同時，對接種污泥采用不合適的預處理方法，有可能抑制住產氫菌的活性，而減小產氫效能［17，24］.在本文采用的預處理方法中，經過BES處理的污泥，其Pmax和Rmax較對照的污泥樣品要小，而采用酸預處理后的效果最好，其Pmax和Rmax分別為171.14 mL和22.26 mL/h，堿處理次之，Pmax和Rmax分別為145.73 mL和20.73 mL/h，這與Lin等［16］的研究結果一致，而Wang等［15］的研究表明，采用熱處理的方法，獲得的效果最好，這可能是由于種泥不同所致.

表1 不同預處理方法下的發酵產氫動力學參數

在各發酵體系反應的初期，由于接種污泥對新環境的調整適應，均表現出一個或長或短的延滯期.其中，經CHCl3和BES處理過的污泥延滯時間(λ)較大，分別為9.37和7.85 h，這可能是由于藥劑的毒性作用所致;而經曝氣、熱處理的污泥，其延滯期較短，分別為3.69和5.66 h;經酸、堿處理的污泥，λ為6.8 h左右，與空白相當.這進一步表明，采用污泥預處理的方法能有效富集產氫菌種，促進厭氧活性污泥的產氫活性，并且不同的預處理方法對原始種泥的菌種選擇作用不同，獲得的效果也存在差異.

2.2 液相末端發酵產物

表2總結了對照及各種污泥樣品發酵體系在第42小時時發酵產物各成分的濃度.由發酵產物組成分析可知，污泥樣品的預處理對其產酸發酵特征有直接影響.由于接種污泥為二沉池的剩余污泥，從污水處理廠取回即用，屬于好氧污泥，污泥中好氧微生物居多，所以，未經處理的污泥，和經曝氣、BES處理后的發酵反應體系，發酵產物均主要以乙醇和乙酸為主，其中，經曝氣預處理后，乙醇和乙酸摩爾分數分別為50.3%、47.0%(表2)，屬典型的乙醇型發酵［8，25］，Ren等［25］也得到了相同的結果.經過熱、CHCl3預處理的污泥，其代謝產物主要以乙醇、乙酸和丁酸為主，其摩爾分數均在30%～40%，屬于混合酸發酵［8］.而經過酸、堿預處理的污泥，其利用葡萄糖發酵進行產氫的產物主要以丁酸和乙酸為主，摩爾分數分別為40.2%、30.8%和44.9%、37.9%，表明酸、堿處理有利于丁酸梭菌屬產氫發酵菌群的富集，這與Yu和Lin等的研究結果一致［14，16］.以上結果表明，不同預處理對種泥原有微生物群落結構的改變存在差異，這可能是導致在相同的培養條件下，各反應體系表現出不同產酸發酵特征的主要原因，Guo等［25］的研究對這一觀點已經提出了有力的證據.

表2 預處理對液相末端發酵產物的影響mmol·L-1

由表2可以看出，經過曝氣處理的污泥，其發酵產物中的丁酸濃度最小，僅為0.25 mmol/L，表明曝氣對丁酸梭菌屬的抑制作用較強，所以，在Guo和Ren等的研究中［8，25］，對污泥采用曝氣預處理，均能較快地實現間歇、連續流的乙醇型發酵，而對污泥采用酸、堿預處理后能形成丁酸型發酵［8，14］.同時，Li等［26］的研究表明，乙醇型發酵較丁酸型發酵其氫氣產率要更高，更利于產氫.然而，在本實驗中，采用曝氣預處理形成的乙醇型發酵，獲得的產氫量較采用酸處理形成的丁酸型發酵類型時的要小(表1)，分析認為，這可能是由于種泥中存在同型產乙酸菌所致.在文獻［8，25-26］中，曝氣預處理的時間一般在1周左右，而本文的曝氣處理僅為24 h，所以，短時間的曝氣難以有效抑制同型產乙酸菌種，而引起了代謝產物中乙酸摩爾分數較大，占到總揮發酸產物的47.0% (表2)，而經酸處理的發酵體系，乙酸摩爾分數僅占30.8%(表2)，這表明經24 h曝氣處理后的污泥，雖然顯著地激活了發酵產氫產乙醇菌種，但對可利用H2和CO2合成乙酸的同型產乙酸菌無明顯抑制作用.如圖1所示，第24小時后的氫氣體積下降，以及無CH4氣體檢出，也間接證明了系統中存在著同型產乙酸菌種.而同型產乙酸菌在發酵制氫系統中的作用，目前，已經成為了一個熱門的研究課題，在Hallenbeck和Bita等［7，9］的研究中均有報道，其作用機制和經濟有效的控制技術還有待深入研究.

2.3 葡萄糖的降解

未經熱處理的和經熱處理過的各污泥樣品，在發酵產氫過程中，對葡萄糖的降解情況存在顯著差異，經預處理的污泥，葡萄糖的降解率均大于未經處理的發酵反應體系.如圖2所示，經過酸、堿、熱處理的污泥，其葡萄糖的降解率均達到了90%以上，其中經熱處理的降解率最大，為91.6%.經CHCl3和BES處理的污泥，其葡萄糖的降解率為70%左右，經曝氣預處理獲得的葡萄糖降解率則為77.5%.以上結果表明，經過酸、堿處理的污泥，在能獲得最大產氫量和最大產氫速率的同時，還能獲得較高的底物降解率.因此，對于利用有機廢水進行發酵產氫來講，以經酸或堿預處理的好氧污泥作為接種污泥是較好的選擇.

圖2 不同預處理方法下葡萄糖的降解

2.4 生物量和pH

各發酵體系在反應42 h后，其生物量都有大幅增長(圖3)，分別從起始的2 g/L左右提高到了7.57(對照)、4.85(酸)、5.02(堿)、5.30(熱)、6.6(曝氣)、7.30(CHCl3)、8.58(BES)g/L.這一生物量增幅顯著高于現有文獻報道的水平［15-16］.由于酸性末端產物的積累(圖3)，各反應體系的pH也分別從初始的7降低到了3.83(對照)、4.35(酸)、4.54(堿)、3.88(熱)、3.95(曝氣)、3.93(CHCl3)、3.91(BES).當pH小于4.0時，會嚴重抑制活性污泥微生物的代謝活性［8］，這可能是導致對照、曝氣、氯仿、BES預處理污泥對葡萄糖的降解率較低的原因(圖2).

2.5 預處理剩余污泥對發酵產氫活性的影響

污泥經其他方法預處理后，被滅活的微生物殘體與芽孢和具有活性的菌體一同被保留在污泥樣品中，是發酵系統中生物量(MLVSS)的組成部分.為此，以新增生物量的比產氫率為指標，比較分析了不同發酵系統微生物群落的代謝活性.由于加入BES對好氧污泥微生物的選擇作用較小，未經預處理和經BES預處理的污泥樣品，保留了原有的所有微生物類群.由于菌體數量基數大，經42 h發酵后，其新增生物量MLVSS顯著高于其他預處理后的發酵體系，未經預處理和經BES預處理的生物產量分別高達0.83和0.96 g(表3).經酸、堿、熱、曝氣、CHCl3預處理的各污泥樣品發酵體系，其新增的生物量分別為0.31，0.35，0.37，0.56，0.78 g，其新增生物量的比產氫率分別為27.29，21.69，13.84，7.14，4.43 mol/kg，分別是未經熱處理污泥樣品的10.45，8.31，5.30，2.74，1.70倍.從表3還可以看出，葡萄糖的氫氣轉化率與生物量的增長量呈現負相關的關系，新增的生長量越大，獲得的產氫轉化率越小，經酸、堿預處理后的發酵系統，生物增長量最小，其單位基質葡萄糖的氫氣轉化率分別達1.51和1.34 mol/ mol，顯著高于其他的發酵系統.以上分析表明，對好氧活性污泥采用適當的預處理，可顯著提高發酵產氫菌群的活性.

圖3 不同預處理條件下終止pH和生物量

表3 不同預處理方法對活性污泥發酵產氫特性的影響

3 結論

1)城市污水處理廠的好氧活性污泥采用合適方法的預處理，可以顯著提高其厭氧發酵產氫活性.采用酸、堿、熱、曝氣、CHCl3均能有效提高種泥的發酵產氫活性，而采用BES的預處理不利于產氫.

2)各種預處理方法獲得的產氫效能由大到小依次為酸＞堿＞熱＞曝氣＞CHCl3＞BES，經酸和堿處理的種泥樣品表現出良好的產氫效能，其葡萄糖的氫氣轉化率分別達到 1.51和1.34 mol/mol，污泥的比產氫率分別為27.29和21.69 mmol/g，而未經處理的污泥，其葡萄糖的氫氣轉化率和污泥的比產氫率僅分別為0.38 mol/ mol和2.61 mmol/g.

3)不同的預處理方法可導致種泥微生物群落結構的差異，在發酵葡萄糖時表現出不同的代謝特征.其中，經酸、堿預處理的發酵體系表現為丁酸型發酵;經曝氣、BES預處理的發酵體系表現為乙醇型發酵;經熱、CHCl3預處理的發酵體系呈現為混合酸發酵特征.

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