奧美沙坦酯對心肌梗死小鼠NADPH氧化酶的作用

張 恒，劉是中

(中國醫科大學臨床醫藥學院，沈陽110001)

體內外研究表明，奧美沙坦酯(OLM)可以阻斷任何來源的血管緊張素Ⅱ所致的相應生理作用［1］。本實驗通過結扎冠狀動脈建立小鼠心肌梗死(MI)模型，應用OLM進行干預性治療，觀察各組動物的心肌纖維化情況、心肌丙二醛(MDA)含量及NADPH氧化酶組分的表達，探討OLM的抗氧化應激作用及對MI后心臟的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡健康雄性清潔級C57小鼠40只，體質量25～30 g，光照12 h/12 h明暗交替，室溫飼養，由中國醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑及儀器 OLM(上海三共制藥有限公司，上海);MDA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);RNA提取試劑盒，cDNA合成試劑盒(寶日醫生物技術有限公司，大連);Real-time PCR反應試劑盒(Applied Biosystems，美國);引物(上海生工生物工程技術服務有限公司，上海);人工呼吸機(HX－100E型，成都泰盟科技有限公司，成都);酶標光度計(SUNRISE RC，TECAN，瑞士)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型建立及分組 隨機分為3組:假手術組(SHAM組，n=8)、MI組(n=10)和OLM組(n =8)。各組小鼠按50 mg/kg腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉，人工呼吸機輔助呼吸。迅速打開左前胸，暴露心臟。用7/0尼龍絲線在左心耳下方2 mm結扎冠狀動脈左前降支，顯微鏡下確認，將心臟復位后擠壓出胸腔內氣體，迅速縫合關閉胸腔，建立MI模型。SHAM組穿線而不結扎動脈，余步驟同MI、OLM組。SHAM組、MI組每天給予正常飼料和飲水，OLM組術后給予正常飼料和飲水的同時開始給予OLM 10 mg/(kg·d)灌胃。3組小鼠術后4周處死并檢測各項指標。

1.3.2 MDA含量的測定 小鼠處死后取出心臟，并用冰生理鹽水洗凈，剪除左右心房、大血管及附著結締組織，取左心室(游離壁和室間隔)非梗死區組織稱重，按1∶9(w∶v)用玻璃勻漿器在4℃制備組織勻漿。3 000 r/min離心15 min，吸取上清待測。心肌組織蛋白定量用Bradford比色法。MDA可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰，具體操作按試劑盒說明書進行。

1.3.3 病理學改變檢測 實驗完成后取心臟組織，吸干表面水分，垂直于心臟左室長軸對稱中點平乳頭肌水平切取厚度為2～3 mm心臟切片，立即置于甲醛溶液中固定，石蠟包埋成蠟塊，切成3 μm切片，AZAN染色后光鏡下觀察結構改變。

1.3.4 Real-time PCR法檢測 取各組心臟左心室非梗死區組織，按照試劑盒要求提取總RNA，并將RNA反轉錄成cDNA，設計相應的引物，應用SYBR Green PCR master mix，在ABI Prism 7900T序列檢測系統檢測分析，反應條件為20 μl反應體系，按94℃ 30 s，然后94℃ 5 s，55℃ 5 s，72℃ 15 s擴增40個循環，分析溶解曲線，計算gp91phox、p22phox和 p47phox樣本的相對濃度。PCR引物:gp91phox上游:5'-CTTTCTCAGGGGTTCCAGTG-3'，下游:5'-TCTTCCAAACTCTCCGCAGT-3';p22phox上游:5'-TGGACGTTTCACACAGTGGT-3'，下游:5'-TAGGCTCAATGGGAGTCCAC-3';p47phox上游:5'-CCACGG GTATTGCTAGGATGA-3'，下游:5'-AGACTAAGGCA GCGGGTAATCA-3';GAPDH上游:5'-CAACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'，下游:5'-ACACATTGGGGGTAGGAACAC-3'。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件包行單因素方差分析，數據以s表示，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病死率及一般情況 SHAM組術后均存活，且一般情況佳;MI組病死率為20%，死因為心力衰竭，其余小鼠均不同程度出現呼吸急促、進食和活動減少等情況;OLM組小鼠均存活，但有輕微的進食、活動減少等情況出現。

2.2 MDA含量 SHAM組、MI組及OLM組心肌組織MDA水平分別為(11.4±1.21)、(27.3±4.18)及(17.8±2.35)nmol/mg prot，與SHAM組相比，MI組心肌組織MDA水平增高(P＜0.05);與MI組相比，OLM組MDA水平降低(P＜0.05)。

2.3 病理結果 AZAN染色結果可見SHAM組小鼠心肌肌肉束飽滿，排列整齊，染成鮮紅色。而MI組小鼠的心肌組織中梗死區藍染，心肌纖維消失，代之以纖維結締組織。OLM組亦可見藍染的纖維結締組織，但與MI組相比面積減少。

2.4 gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表達見表1。

表2 不同組別心肌組織中gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表達比較(n=8，s)

表2 不同組別心肌組織中gp91phox、p22phox和p47phox mRNA表達比較(n=8，s)

注:與SHAM組比較，*P＜0.05;與MI組比較，△P＜0.05

gp91phox p22phox p47phox SHAM組組別0.2±0.05 1.05±0.07 1.0±0.11 MI組 1.36±0.07* 2.15±0.14* 1.57±0.06* OLM組 0.45±0.09△ 1.65±0.09△ 1.23±0.09△

3 討論

體內活性氧(ROS)被認為是氧化應激的主要原因［2］，包括超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基、單線態氧、過氧化脂類等。雖然心臟中ROS來源廣泛，但研究發現NADPH氧化酶是產生ROS的重要來源［3］。NADPH氧化酶由2個膜結合成份(gp91phox和p22phox)，3個胞質成份(p47phox、p67phox和p40phox)，以及1個小分子G蛋白(rac-1或rac-2)組成［4］。研究發現，NADPH氧化酶可催化O2產生超氧陰離子，后者可通過岐化作用生成過氧化氫，過氧化氫進而能與超氧陰離子反應生成羥自由基，如此產生的大量的ROS可以導致氧化與抗氧化水平的失衡而引起細胞氧化應激損傷。

在正常及病理條件下，NADPH氧化酶源ROS對決定細胞內的氧化-還原平衡是至關重要的。心血管系統非吞噬細胞NADPH氧化酶為組成性表達，可持續生成低水平的超氧化物。然而在生理及病理條件下，NADPH氧化酶也可產生爆發性超氧化物。目前認為，NADPH氧化酶是心臟中超氧陰離子產生的最主要的調控酶之一［5］。研究顯示，MI后ROS產生增加與AngⅡ上調NADPH氧化酶密切相關，AngⅡ可與AngⅡ1型受體結合而激活NADPH氧化酶，啟動活性氧的生成［6］。隨著NADPH氧化酶活性表達的增加，氧化應激的程度也隨之加重。

Yu等［7］報道使用AngⅡ受體阻斷劑可抑制心衰大鼠心肌氧化應激水平及心室重構。本研究中，我們的結果也顯示，MI后心肌發生氧化應激損傷，膜脂過氧化最重要的產物之一MDA含量及NADPH氧化酶組分表達顯著升高，應用AngⅡ受體阻斷劑OLM后，MDA含量及NADPH氧化酶組分表達顯著降低，MI面積明顯減少，心肌損傷明顯減輕。說明OLM對NADPH氧化酶系統激活有良好的抑制作用。但是OLM未能完全抑制心臟氧化應激的發展，說明NADPH氧化酶不是心臟ROS生成的惟一來源。詳細機制有待進一步的研究。

［1］Koike H，Sada T，Mizuno M.In vitro and in vivo pharmacology of olmesartan medoxomil，an angiotensinⅡtype AT1 receptor antagonist［J］.J Hypertens Suppl，2001，19(1):S3-14.

［2］Martinon F.Signaling by ROS drives inflammasome activation［J］.Eur J Immunol，2010，40(3):616-619.

［3］Chan EC，Jiang F，Peshavariya HM，et al.Regulation of cell proliferation by NADPH oxidase-mediated signaling:potential roles in tissue repair，regenerative medicine and tissue engineering［J］.Pharmacol Ther，2009，122(2):97-108.

［4］Brandes RP，Kreuzer J.Vascular NADPH oxidases:molecular mechanisms of activation［J］.Cardiovasc Res，2005，65(1):16-27.

［5］Inagi R.Oxidative stress in cardiovascular disease:a new avenue toward future therapeutic approaches［J］.Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2006，1(2):151-159.

［6］Garrido AM，Griendling KK.NADPH oxidases and angiotensinⅡreceptor signaling［J］.Mol Cell Endocrinol，2009，302(2):148-158.

［7］Yu Y，Fukuda N，Yao EH，et al.Effects of an ARB on endothelial progenitor cell function and cardiovascular oxidation in hypertension［J］.Am J Hypertens，2008，21(1):72-77.