牛瘦素受體基因表達及其結合瘦素特性研究

李林強,田萬強,昝林森

(1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西 西安 710062;2.楊凌職業技術學院動物工程系,陜西 楊凌 712100;3.西北農林科技大學動物科技學院,陜西 楊凌 712100)

牛瘦素受體基因表達及其結合瘦素特性研究

李林強1,田萬強2,3,昝林森＊3

(1.陜西師范大學食品工程與營養科學學院,陜西 西安 710062;2.楊凌職業技術學院動物工程系,陜西 楊凌 712100;3.西北農林科技大學動物科技學院,陜西 楊凌 712100)

[目的]以秦川牛為研究對象,克隆、原核表達秦川牛瘦素受體(Lepr)基因的蛋白功能區,分析表達蛋白對瘦素結合特性,為研究瘦素受體與瘦素結合的調節機制提供理論基礎。[方法]本研究通過RT-PCR法從秦川牛肉m RNA擴增獲得Lepr IG基因的cDNA序列,克隆至p MD18-T載體獲得重組質粒,并進行序列測定。將測序正確的cDNA序列定向克隆到p ET 30a(NdeI/XhoI),構建表達載體,并轉化BL21(DE3)大腸桿菌,IPTG誘導后進行SDS-PAGE分析,鎳柱親和層析法分離純化融合蛋白,高效液相色譜—迎頭法分析重組表達蛋白對廋素結合功能。[結果]表明秦川牛Lepr IG基因在大腸桿菌中獲得高效表達;Lepr IG融合蛋白以可溶性和包涵體2種形式表達;高效液相色譜—迎頭分析法進一步表明重組表達蛋白具有結合瘦素的功能。[結論]秦川牛Lepr IG基因在大腸桿菌中獲得高效表達,表達蛋白具有結合瘦素的功能,為通過調節瘦素受體對瘦素結合,抑制能量代謝,促進秦川牛脂肪沉積奠定了基礎。

牛;瘦素受體;IG 基因;克隆;表達

Leptin具有參與調節攝食、能量代謝等功能,通過其受體(Leptin receptor,Lepr)發揮調節作用。因此,瘦素受體在調節體脂平衡和能量代謝等方面發揮著重要作用。Tartaglia等(1995)首先發現存在于小鼠脈絡叢內的leptin受體(OB-R),并測得小鼠的OB-R m RNA呈單個帶狀,長度約 5.1 kb[1]。OB-R是一種跨膜受體,由細胞外的配體結合區、跨膜區及胞內區三部分組成[2]。小鼠的OB-R由894個氨基酸殘基組成,人的OB-R由1165個氨基酸殘基組成。在小鼠中 Leptin受體存在OB-Ra、OBRb、OB-Rc、OB-Rd和OB-Re 5種異形體(isoform),其中只有OB-Rb屬于長受體,具有信號轉導功能,為功能受體,其它的均為短受體。長受體與短受體的胞外長度一致,它們之間的差異在于胞內結構域的長度不同。這些異形體的胞外結構域、跨膜結構域及胞內結構域中頭29個氨基酸序列完全相同[3]。OB-Rb的胞內區含有2個結構域,一個可以激活Janus激酶(Just another kinase或Janus kinase,JAK),另一個可以和轉錄蛋白的激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)相互作用,借以調節轉錄,OB-Rb是唯一能進行信號轉導并調節熱量攝入和能量消耗的異形體[4]。目前研究最多的是OBRa,其胞內結構域由33個氨基酸組成,它不能激活JAK激酶,也不能激活STA Ts。因此,它不具有信號傳遞功能,它可能作為Leptin的結合蛋白,調節游離的 Leptin濃度或作為 Leptin轉運蛋白,使Leptin經過血腦屏障到達其作用位點[4,5]。OB-Re是唯一的可溶性受體,其功能是作為轉運蛋白,OB2Rc和OB2Rd的功能目前尚不清楚。

目前,對瘦素、瘦素受體基因及其功能的研究主要集中于人和小鼠,主要是為了研究人類肥胖疾病產生的機理、預防和治療方法,對黃牛OB-R研究尚處初級階段,本文以中國五大黃牛之一的秦川牛為研究對象,克隆表達OB-R基因的蛋白結合區,為調控OB-R與Leptin的結合,抑制牛能量代謝,促進牛肌間脂肪沉積提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 PCR擴增目的片段

采用T rizol法提取秦川牛肌肉組織基因組m RN A,DNA酶處理后,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測核糖體RNA 28S和18S帶的完整性(紫外分光光度計測定波長260 nm和280 nm處的OD值1.8～2.0)。用Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas Life Science)反轉錄得到cDNA。RT-PCR獲得目標基因,引物序列見表1。RT-PCR條件:95℃3 min,1個循環;94℃20 s;55℃20 s;72℃1 min 40 s,35個循環;72℃10min,1個循環。

表1 RT-PCR引物

1.2 克隆載體的構建

回收純化 PCR產物,將獲得的 1728 bp的Lepr基因cDNA序列連接 T-Vector(pMD18-T載體),4℃連接過夜,熱擊轉化大腸桿菌DH5α,挑12個克隆進行PCR,然后進行質粒抽提,酶切鑒定插入片段。

表 2 p ET 30a酶切體系

表3 Lepr基因和p ET 30a(Nde1/Xho1)連接體系

1.3 表達載體的構建以及在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達

將陽性克隆及表達載體pET 30a質粒經NdeI和XhoI雙酶切(酶切體系見表2)后,回收1728 bp的片段以及載體大片段,將目的片段和載體大片段連接(連接體系見表3)過夜后轉化BL21(DE3)感受態細胞。菌液PCR初步鑒定正確后,提取質粒,用NdeI和XhoI鑒定正確后測序。挑取測序正確的單克隆于5 mL含100m g/L氨芐的 LB液體培養基中37 ℃恒溫振蕩培養 12～14 h。次日,按1∶100擴大培養至OD值為0.6時,加IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續誘導培養3 h,同時將空載體p ET 30a的誘導表達作陰性對照。在不同的時間點收集菌液,以10000 r/min速度離心10min沉淀菌體,加入SDS蛋白上樣緩沖液混勻后,煮沸10min,離心取上清10μL進行SDS-PAGE。

1.4 目標蛋白親和純化(His-tag親和柱)

利用His-tag親和柱進行目的蛋白的純化。

1.5 Lepr蛋白與Leptin結合作用高效液相色譜—迎頭分析法(high performance liquid chromatography-frontal analysis,HPLC-FA)

高效液相色譜一迎頭分析法(HPLC-FA)是基于凝膠過濾迎頭分析法的原理發展起來的色譜方法,適宜高親和勢的蛋白結合作用的分析,樣品可不經任何處理直接進樣分析,通過柱切換和手性色譜柱相連,可進行蛋白結合作用的立體選擇性研究。

色譜條件:日本分光公司JascoUV-975紫外可見分光光度檢測器;色譜柱為Pinkerton GFF II-S5-80內表面反相(IS RP)柱,150mm×4.6 mm ID,5 μm(Regis Chemical Company,Illinois,USA);流動相為67 mmol·L-1磷酸鹽等滲緩沖液(p H 7.4,I=0.17 mol·L-1);流速0.2 m L·min-1;紫外檢測波長290 nm;進樣量900μL;柱溫37℃。

樣品溶液的配制:吸取500μL Leptin(0.1 ng/μg)溶液于容量瓶中,然后加入等體積的Lepr蛋白溶液(0.12 mg/mL),加入5 mL等滲磷酸鹽緩沖液,搖勻,37℃溫育1 h。以Leptin和Lepr蛋白溶液為對照。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR克隆秦川牛Lepr產物電泳檢測

RTμPCR克隆秦川牛Lepr產物電泳檢測結果見圖1。由圖1可見所獲目的基因在1750 bp附近,與預測結果一致。由圖2可見測序結果與NCBI原序列比較同源性達99.77%。

圖1 RT-PCR克隆秦川牛Lepr產物電泳檢測

2.2 酶切鑒定插入片段鑒定

連接產物轉化大腸桿菌后,選擇白色菌落進行PCR,提取陽性菌落質粒用NdeI和XhoI進行雙酶切鑒定,結果見圖 2。結果表明 Lepr基因插入pMD18-T克隆載體。

圖2 牛Lepr原核表達質粒雙酶切鑒定

2.3 表達檢測及高表達菌株篩選

將轉化 pMD18-T和p ET 30a的BL-21(DE3)陽性克隆菌液在37℃、1 mM IPTG誘導3 h后收集菌體,進行SDS-PAGE電泳,結果見圖3。由圖3可見克隆得到了約66 k D的預期蛋白特異帶,與理論估計的相對分子質量相符。表明菌株誘導后都有明顯的目標蛋白Lepr表達(箭頭標記處)。

圖3 表達檢測及高表達菌株篩選

2.4 目標蛋白親和純化(His-tag親和柱)

將菌體懸浮于PBS溶液中反復凍融3次,每克菌體加入80μL 10mg/L的溶菌酶及 40μL 100 nml/LPMSF(蛋白酶抑制劑)混勻,4℃放置30min后超聲波破碎菌體,然后4℃8000×g離心15 min,分別收集上清和沉淀(沉淀主要為包涵體)進行SDS-PAGE。結果表明融合蛋白在上清中表達,也以包涵體的形式表達,不過上清中的表達量要大于包涵體,即融合蛋白可溶性表達大于包涵體表達(圖4)。結果表明通過His親和柱的分步純化,可以從破菌上清中獲得純度合格目標蛋白Lepr(泳道F,箭頭標記處)。

圖4 目標蛋白親和純化

2.5 Lepr蛋白與Leptin結合作用HPLC-FA分析

Lepr蛋白與Leptin 37℃溫育1 h經過HPLCFA,結果表明產生了新物質。結果提示Lepr蛋白與Leptin發生了一定程度的結合,進一步表明克隆表達的Lepr的蛋白結合區具有結合Leptin的功能。

3 討論

Kielar等(1998)報道在下丘腦腹內側核、側部及弓狀核存在有豐富的Leptin受體,在其它部位,如心 、胎盤 、肝 、腎 、胰 、脾 、肌肉 、胸腺 、前列腺 、睪丸 、卵巢、小腸、結腸、腎上腺中均有表達,但水平較低[6],與本文 Lepr組織表達特性研究結果基本相同。Houseknecht等(1996)報道,分泌到血液中的Leptin大部分通過與血清蛋白結合來運輸,而后與下丘腦的Leptin受體結合,通過信號轉導途徑而發揮其生物學效應[7,8]。Wabitsch等(1996)也認為leptin與位于下丘腦及脂肪組織的Lepr結合,會產生抑制食欲、減少能量攝取、增加能量消耗、抑制脂肪合成的作用[9]。表明Lepr功能區表達重組蛋白與血清中leptin可能結合,進而可能抑制leptin與位于下丘腦Lepr的結合。

大理石花紋是評價牛肉品質的兩個主要指標(大理石花紋和嫩度)之一。肌內脂肪組織比較豐富的牛肉在視覺上呈現大理石花紋狀[10,11],而大理石花紋是日本[12,13],美國[14],韓國[15,16],中國等國牛肉品質分級的主要指標。因此,提高牛肉肌內脂肪含量,增加大理石花紋豐富度是肉牛生產研究的熱點。本文克隆和表達Lepr蛋白結合區,結果表明該段基因可進行表達。通過HPLC-FA分析表達蛋白對Leptin的結合特性,結果表明Lepr功能區表達重組蛋白與 Leptin發生了一定程度的結合。這就為Lepr功能區表達重組蛋白對下丘腦Lepr與Leptin結合產生競爭性抑制,從而抑制牛能量代謝,促進牛肌內脂肪的沉積,以及為抑制牛能量代謝微生態制劑的開發提供一定的理論基礎。當然,攝食和能量代謝的調節是多種神經遞質在下丘腦互作的結果,因此,要闡明Lepr蛋白結合區對牛肌內脂肪調節機理還有許多要解決的問題。

[1]Tartaglia L A,Demb ski M,Weng X,et a l.Identification and expression cloning of a leptinrecep tor,OB-R[J].Cell,1995,83(7):1263-1271.

[2]M atsu ok a N,Ogaw a Y,Hosoda K,et a l.Human leptin receptor gene in obese Japanese subjects:evidence against eitherobesity-cau sing mutations or association of sequence variants with obesity[J].Diabetologia,1997,40:1204-1210.

[3]Ghilardi N,Skoda R C.T he Leptin receptor Activates Janus Kin ase 2 and Signals for Proliferation in a Factor-Dependent Cell Line[J].Molecular Endocrinology,1997,11(4):393-399.

[4]Ihle J N.Signaltran sducers and activators of transcription[J].Cell,1996,84:311-334.

[5]Reichlin S.Is Leptin a Secretion of th e Brain?[J].The Journal of Clinical Endocrin ology&Metabolism,1999,84(7):2267-2269.

[6]Kielar D,Clark J S C,Ciech anow icz A,et al.Leptin receptor is of ormsex pressed in human adipose tissue[J].Metabolism,1998,47(7):844-847.

[7]Houseknecht K L,Mantzoros C S,Kuliaw at R,et al.Evidence for leptin binding to proteins in serum of rodents and humans:modulation with obesity[J].Diabetes,1996,(45):1638-1643.

[8]Sinh a M K,Oh annesian J P,Heiman M,et a l.Nocturnal rise of leptin in lean,obese,and n on-in sulin-dependent diabetes mellitus subjects[J].Jou rn al of Clinical,1996,97(5):1344-1347.

[9]Wabitsch M,Jensen P B,Blum W F,eta l.Insulin and cortisol promote leptin production in cu ltured hum an fat cells[J].Diabetes,1996,(45):1435-1438.

[10]Woodw ard B W,Fernández M I.Comparison of conventional and organic beef production systems II.Carcass characteristics[J].Livestock Produ ction Science,1999,(61):225-231.

[11]Indurain G,Beriain M J,G oni M V,et a l.Com position and estimation of intramuscular and subcutaneous fatty acid composition in Spanish young bulls[J].Meat Science,2006,(73):326-334.

[12]JMGA.New Beef Carcass Grading Standards[R].Tokyo:Japan Meat Grading Association,1998.

[13]Yoshikaw a F,T oraichi K,Wada K,et a l.On a grading system for beef marbling[J].Pattern Recognition Letters,2000,(21):1037-1050.

[14]USDA.Official United States Standards for Grades of Carcass Beef[R].Washington,D C:Agricultural Marketing Service,1997.

[15]APGS.Report of Business for Animal Products Grading.Animal Products Grading System[R].Seoul:National Livestock Cooperatives Federation,1995.

[16]Kim C J,Lee E S.Effects of quality grade on the chemical,physical and sensory characteristics of Hanwoo(Korean native cattle)beef[J].Meat Science,2003,(63):397-405.

Studies on Protein Expression of Functional Region of Leptin Receptor Gene and its Character of Combinding Leptin in Cattle

LI Lin-qiang1,TIAN Wan-qiang2,3,ZAN Lin-sen＊3

(1.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi'an,Shaanxi 710062,China;2.Department of Animal Engineering,Yang ling Vocational&Technical College,Yangling,Shaan xi 712100,China;3 College of Animal Science and Tech no logy,North west A&F Universit,Yang ling,S haan xi 712100,China)

【Objective】In this paper,the functional region of leptin receptor IG gene was cloned and ex-pressed,the expressed protein combining leptin properties were analyzed,which would provide theoretical basis for the regulation of Lepr and leptin combinding.【Method】T he cDNA of Lepr IG gene was amplified from muscle m RNA of Qinchuan cattle by RT-PCR.The PCR product was cloned into the T vector pMD18-T to construct plasmid for sequencing.Then the cDNA was subcloned into the prokaryotic expressing plasmid vector pET 30a(NdeI/Xho1)and transformed into host Escherichia coli strain BL2l(DE3)for expression.The expression of Lepr function protein was induced by IPTG,and was identified by SDSPAGE.The protein was purified by Ni NTA column.Combinding leptin function of the expressed recombinant protein via high performance liquid chromatography frontal analysis(HPLC-FA).【Result】The results showed that Lepr IG gene was highly expressed in Escherichia coli,and the expression product was observed with soluble protein and inclusion body,the expressed recombinant protein had the function of combinding leptin.【Conclusion】In vitro expressed exogenous,Lepr IG gene protein had combinding leptin function and the study provided the foundation for inhibitting Qinchuan cattle energy metabolism and fat deposition through regulation of Lepr on combinding leptin.

Cattle;leptin Receptor;IG gene;Cloning;Expression

S823.2

A

1001-9111(2011)04-0001-05

2011-03-15

2011-04-22

陜西省13115科技創新工程(No.2010ZDGC-01),教育部長江學者與創新團隊發展支持計劃(No.IRt 0940)。

李林強(1971-),男,陜西扶風人,博士,研究方向為畜產品加工、動物資源開發與利用。

＊通訊作者:昝林森(1963-),男,陜西扶風人,教授,博士生導師,研究方向為肉牛、奶牛遺傳改良與生長發育調控。