EGCG對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-9表達(dá)及活性的影響

陽(yáng)文任 梁慶模

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma Multiforme，GBM）是常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性神經(jīng)上皮細(xì)胞腫瘤，占腦癌病例中一半以上。在世界范圍內(nèi)，每年診斷出的此類病例大約有175，000人，大多數(shù)癌癥通過(guò)癌細(xì)胞擴(kuò)散全身而導(dǎo)致死亡[1]。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是腦膠質(zhì)瘤最重要的生物學(xué)行為，其中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類降解結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程中必不可少的酶，幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分。在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[2]。本研究試圖探討綠茶提取物表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)在人星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，對(duì)佛波脂誘導(dǎo)的MMP-9表達(dá)有何影響，從而豐富EGCG的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保存中心（武漢）。Wizard DNA純化試劑盒為Promege 產(chǎn)品；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京博大泰克公司。DNA Marker DL15,000購(gòu)自大連TaKara生物工程公司、100bp DNALadder購(gòu)自北京鈞堯偉業(yè)生物技術(shù)公司；氨芐青霉素、鏈霉素購(gòu)自華美公司。其余試劑主要購(gòu)自上海生工生物工程公司和江蘇碧云天等公司。

1.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG的培養(yǎng)與EGCG處理

星形神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87MG于無(wú)抗生素的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取U87MG傳代30～36h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞(約70%～80%融合)，以每孔0.5×105細(xì)胞平均接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔體積1ml，置于37℃、5% CO2、飽和濕度的環(huán)境中培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)按實(shí)驗(yàn)要求加入不同濃度(0、5、10、20μM)的EGCG，另每孔加100ng/ml的PMA。37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞和上清液。

1.3 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

條件培養(yǎng)液經(jīng)含2mg/ml明膠A和明膠B的聚丙烯酰胺凝膠（8%）中電泳。電泳結(jié)束后，凝膠置于含2.5%的 Triton X-100中振蕩洗脫3次，每次30min以去除SDS。然后將凝膠放入100 mL孵育液（100mM Tris-HCl，10mM CaCl2）37℃中孵育24h，經(jīng)染色(0.5%考馬斯亮藍(lán))、脫色后，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.4 免疫印跡

細(xì)胞處理結(jié)束后，采用總蛋白提取試劑盒提全細(xì)胞蛋白。用BCA方法定量后，100℃煮沸5min，取20μl蛋白用于SDSPAGE。電泳結(jié)束后，用半干轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)膜，洗膜結(jié)束后用MMP-9多克隆抗體（Santa Cruz）孵育，洗膜，孵育二抗，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。同時(shí)采用β-actin抗體作為內(nèi)參。

1.5 RT-PCR

細(xì)胞處理結(jié)束后，用Trizol試劑提取總RNA。使用AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物9聚體合成第一鏈cDNA。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5min，隨后95℃ 30s,60℃ 45s,72℃ for 30s。共30循環(huán)，最后在72℃下延伸7min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳并經(jīng)凝膠成象系統(tǒng)成像。

2 結(jié)果

2.1 EGCG對(duì)PMA誘導(dǎo)MMP-9基因轉(zhuǎn)錄的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，EGCG處理后，與對(duì)照組相比，MMP-9基因mRNA水平隨EGCG濃度的增高而降低（圖1A）。內(nèi)參在所有時(shí)間段保持恒定（圖3B）。

圖1 EGCG對(duì)U87MG細(xì)胞中MMP-9基因轉(zhuǎn)錄的影響

2.2 EGCG對(duì)MMP-9蛋白表達(dá)的影響

Western blot證實(shí)，表明EGCG能抑制U87MG細(xì)胞MMP-9蛋白的表達(dá)，并隨著EGCG濃度的增加，其表達(dá)水平逐漸降低（圖2A）。β-actin在所有組中無(wú)明顯影響(圖2B)。

圖2 EGCG對(duì)U87MG細(xì)胞中MMP-9表達(dá)的影響

2.3 EGCG對(duì)PMA誘導(dǎo)MMP-9的酶活性的改變情況

取U87MG細(xì)胞與EGCG共孵育48h后的培養(yǎng)上清，以明膠為底物，酶譜檢測(cè)MMPs的表達(dá)及活性(見(jiàn)圖3)，表明EGCG能抑制PMA誘導(dǎo)的RU87MG細(xì)胞MMP-9的活性，且隨著EGCG濃度的增加，U87MG細(xì)胞MMP-9的酶活性減弱越明顯。

圖3 EGCG對(duì)PMA誘導(dǎo)RU87MG細(xì)胞MMP-9的酶活性影響

3 討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是腦原發(fā)腫瘤中發(fā)病率最高、治愈率最低、治療效果最差的一類腫瘤。可發(fā)生于任何年齡，以成人多見(jiàn)。原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤的5年生產(chǎn)率約為20%，兒童期腫瘤的5年生存率預(yù)期為72%，主要是因?yàn)镚BM等惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后較差。在成年人，GBM 2年平均生存率只有10%～25%。GBM呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，病程迅速進(jìn)展，手術(shù)切除后常很快復(fù)發(fā)。惡性腫瘤病人治療失敗和致死的主要原因就是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。在已知的惡性腫瘤中，除皮膚基底細(xì)胞癌、某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤極少發(fā)生轉(zhuǎn)移外，其他絕大多數(shù)腫瘤在疾病的進(jìn)展過(guò)程中都可以發(fā)生轉(zhuǎn)移。而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)多階段的過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分特異性粘附、降解ECM以及降解區(qū)域趨化因子的釋放等。其中，腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的一個(gè)必需步驟就是穿越基底膜侵入周圍基質(zhì)。許多研究發(fā)現(xiàn)，該過(guò)程常伴隨著MMP-9表達(dá)與活性的增高，這為臨床給予早期干預(yù)措施提供了重要依據(jù)[4]。

本實(shí)驗(yàn)從探索EGCG對(duì)U87MG細(xì)胞MMP-9酶活性的影響入手，研究表明EGCG能抑制PMA誘導(dǎo)的RU87MG細(xì)胞MMP-9的活性，且隨著EGCG濃度的增加，U87MG細(xì)胞MMP-9的酶活性減弱越明顯。并從基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平研究了其可能的機(jī)制，研究表明EGCG可以從基因及蛋白水平抑制MMP-9的酶活性，說(shuō)明EGCG是一種潛在的MMP-9酶抑制劑。GBM的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散常意味著預(yù)后差[6]。了解其轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散的分子機(jī)制，采取相應(yīng)的靶治療對(duì)控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，提高晚期患者的生存率有重要的意義。本研究表明EGCG能明顯降低MMP-9基因的表達(dá)水平和活性，從而發(fā)揮其抗腫瘤活性，然而具體的調(diào)控機(jī)制還有待我們進(jìn)一步研究。

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