產志賀毒素EHEC國內分離株Stx2基因的克隆及生物信息學分析

唐中偉，周志江

（1.山西農業大學生命科學學院，山西 太谷 030801；2.天津大學農業與生物工程學院，天津 300072）

腸道出血性大腸桿菌（EHEC）O157∶H7會引起腸道疾病[1-6]、溶血性尿毒綜合征及腦癥等并發癥[7]，其主要致病因子是志賀毒素（Stx）。Stx分為2類，即Stx1和Stx2。Stx2又有數個變異型，主要是Stx2，Stx2c和Stx2d。Stx2不同變異型對培養細胞和動物的毒性有差異[8]，引起的臨床癥狀輕重也不同[9]。

因此，研究該菌Stx2的分型對闡明毒素的分類、正確診斷疾病和判斷疾病的預后都具有重要意義。我國1987年報道從腹瀉患者中分離出該菌[10-11]，同時也從牛肉、豬肉及牛糞樣品中分離出該菌[12]。我國江蘇和廣西等地從人和動物多次檢測出該菌[13-14]。本研究選取3株國內分離的EHEC菌株，對其Stx2基因進行克隆和測序，以確定它們的分類地位。

1 材料和方法

1.1 菌株和質粒

EHECO157∶H7菌株94H分離自山東一腹瀉患者；EHEC O157∶H7菌株094和EHEC O8菌株042分離自牛糞[12]。受體菌DH5α、質粒載體pMD-18 Tvector為寶生物大連有限公司產品。

1.2 試劑

PCR試劑盒、氨芐青霉素（AP）和DL 2000 Marker購自寶生物大連有限公司，DNA回收試劑盒購自北京鼎國生物技術中心。

1.3 Stx2基因的擴增

根據Stx2基因序列設計合成1對引物，分別是 Stx2u:5′GGAACACCTGTATATGAAGTG3′和 Stx2d:5′GTTACCCACATACCACGAATG3′。兩引物跨越整個Stx2基因，預期擴增片段大小為1282 bp。PCR后做瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，于紫外檢測儀下觀察。

1.4 Stx2基因的連接和轉化

將PCR產物純化后，連接到pMD－18 T vector，轉化感受態細菌DH5α，在含AP的SOB平板培養基中37℃過夜培養，挑取白色菌落，接種于含AP的LB培養基中，37℃過夜培養，提取重組質粒，再按上述PCR擴增條件鑒定重組效果。

1.5 Stx2基因的核苷酸序列分析

由寶生物大連有限公司進行序列測定。

2 結果與分析

2.1 Stx2基因的擴增和克隆

經PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得產物約1282 bp，與預期大小相符。經重組轉化后，從轉化子提取重組質粒作為模板，再做PCR，同樣擴增出了約1282 bp DNA片段（圖1），表明已克隆出各菌株的Stx2基因。

2.2 Stx2基因的核苷酸序列分析及其編碼的氨基酸序列分析

用Stx2u和Stx2d引物分別測得3株菌的Stx2的序列，用計算機軟件DNASIS分析它們與業已發表的Stx2，Stx2c，Stx2d序列的同源性。

經分析（圖2），EHEC 94H的Stx2序列與標準株Stx2核苷酸序列同源性為99.8%，EHEC 042的Stx2序列與Stx2核苷酸序列同源性為98.9%，EHEC 094的Stx2序列與Stx2核苷酸序列同源性為97.9%。

經分析（圖3），EHEC 94H的Stx2序列與Stx2c核苷酸序列同源性為99.5%，EHEC 042的Stx2序列與Stx2c核苷酸序列同源性為98.9%，EHEC 094的Stx2序列與Stx2c核苷酸序列同源性為98.0%。

經分析（圖4），94H的Stx2序列與Stx2d核苷酸序列同源性為90.9%，042的Stx2序列與Stx2d核苷酸序列同源性為90.5%，094的Stx2序列與Stx2d核苷酸序列同源性為87.1%。

經分析（圖5），EHEC 94H與042的Stx2核苷酸序列同源性為98.8%，與094的Stx2核苷酸序列同源性為97.9%。

Stx2，Stx2c，Stx2d 序 列 和 94H，094，042 的Stx2序列分別編碼的B亞基氨基酸序列比較如下（每組從上至下依次為Stx2，Stx2c，Stx2d序列和94H，042，094的Stx2序列）:

經比較（圖6），EHEC 094的Stx2序列編碼的B亞基與Stx2d序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%，EHEC 94H的Stx2序列編碼的B亞基與Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%；EHEC 042的Stx2序列編碼的B亞基與Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為97.7%。

3 討論

Stx2變異型的不同，表現為它們抗原性和毒性有所不同，主要是它們B亞基序列的不同所致，而B亞基的不同又決定了毒素與什么樣的受體結合或決定與受體結合的親疏。由于94H，094，042的Stx2序列核苷酸密碼發生了改變，因而編碼出的氨基酸也發生了改變。特別是B亞基氨基酸序列發生改變，對于3株EHEC國內分離菌株的生物學特性會產生一定的影響。

經DNASIS軟件分析，從人類患者分離的94H的Stx2序列編碼的B亞基與標準株Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%；從牛糞分離的菌株042的Stx2序列編碼的B亞基氨基酸序列與標準株Stx2序列編碼的B亞基的同源性為97.7%，屬于較強毒株；從牛糞分離的菌株094的Stx2序列編碼的B亞基與強毒株Stx2d編碼的B亞基氨基酸序列同源性為100%。目前，已證明Stx2d的毒性大于Stx2，由此可以預見，094產生的毒素與受體結合強度較94H和042強，可能導致的毒性也較強。

上述分析明確了我國分離的產志賀毒素的大腸桿菌，特別是大腸桿菌O157∶H7的Stx2基因型及其毒素分型，這為開展分子流行病學調查和及時準確診治其感染，控制其在我國的流行，也為下一步研究菌苗和抗體提供了依據。

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