止喘湯對哮喘大鼠模型氣道重構中MMP-9、TIMP-1表達的影響*

霍博雅，張占鋒

哮喘是嚴重影響人體健康的慢性呼吸道炎癥性疾病，其臨床特點是慢性進行性和難以根治性。氣道重構是氣道炎癥反復損傷和修復的結果，是造成哮喘患者不可逆氣道阻塞的重要原因［1］。目前，對于哮喘氣道重構仍缺乏有效的治療方法。通過對哮喘大鼠模型氣道重構的動態觀察發現，基質金屬蛋白酶-9/基質金屬蛋白酶抑制劑-9(MMP-9/TIMP-1)比例可以作為一種顯示哮喘氣道組織破壞和修復之間平衡的標志，采取措施抑制MMP-9的過度表達，調節MMP-9/TIMP-1的平衡可以干預氣道重構［2］。本實驗用大鼠哮喘模型觀察中藥對氣道壁結構及MMP-9、TIMP-1表達的影響，探討中藥復方在哮喘氣道壁重構中的作用、可能的機制以及存在的優勢。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑、儀器

8周齡SPF級雄性SD大鼠50只，體重200g±20g，由遼寧醫學院實驗動物中心提供。主要試劑和藥品:卵清白蛋白(GradeIII OVA，sigmaA5378)，MMP-9、TIMP-1、IV型膠原多克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)。黃芩和止喘湯:各取生藥500g，分別加8倍量的水，各提取2次，每次1h，過濾，常壓濃縮至500ml(遼寧醫學院三附院中藥制劑室)。西藥:BUD氣霧劑(阿斯利康制藥有限公司，批號國藥準字H20030410，規格5ml:20mg)。JWC–201D超聲霧化器(遼寧鞍山市同信醫用儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將上述大鼠置于遼寧醫學院基礎醫學院標準動物實驗室內分籠飼養，自由飲水和進食，觀察 7d，所有大鼠反應正常，把大鼠隨機分為正常組、哮喘組、BUD組、黃芩組和止喘湯組5組，每組10只。

1.2.2 哮喘動物模型的復制 參照Holgate等［1］的方法復制大鼠慢性哮喘模型。第1、8天腹腔注射10%的 OVA混懸液 1ml［內含 OVA100mg、AL(OH)3100mg］致敏，自15d始分別將各組大鼠置于30×30×40cm有進出兩口的有機玻璃箱內，1%OVA溶液霧化吸入，0.5ml/min，30min/次，1 次/d，共 6 周。中藥組:每次激發前30min中藥灌胃(按大鼠體質量1ml/100g);BUD組:激發前30min生理鹽水灌胃及5ml:1mgBUD霧化吸入;哮喘組激發前30min生理鹽水灌胃;正常組腹腔注射、灌胃及霧化吸入以生理鹽水代替。以大鼠呼吸急促、口唇發紺、點頭呼吸及站立不穩等表現為模型建立成功的標志。

1.2.3 取材及測定方法 各組動物均于最后1次激發24h內處死并收集肺組織標本。取右肺中葉肺組織標本4%的多聚甲醛固定后，進行脫水、透明、垂直于氣道取材，石蠟包埋、切片、片厚 4μm。一部分切片按HE常規染色步驟染色。另一部分切片作免疫組化處理:采用SP法并嚴格按照試劑盒說明書進行操作，采用微波抗原修復，各組分別滴加1∶200的一抗，陰性對照以PBS代替一抗，其余條件相同。染色判斷標準:陰性為不著色，弱陽性呈淡黃色，陽性呈黃色，強陽性呈棕黃色和棕色。

1.2.4 氣道形態學參數測量及免疫組化半定量分析 氣道形態學參數測量:每組隨機抽取10張切片，每張切片選取3支直徑為200μm左右完整無斜切的小支氣管，參照文獻［3］關于氣道各層的定義，采用病理圖像分析系統測定各支氣管基底膜周徑(Pbm)、外壁面積(WAo)、內壁面積(WAi)及氣道平滑肌面積 (WAm)，并用 Pbm將測量值標準化，以消除管徑大小、氣道狀態以及切片方向不同等所造成的差別，分別以 WAo/Pbm、WAi/Pbm、WAm/Pbm表示相應管壁層的厚度。免疫組化半定量分析:隨機取10個視野，采用計算機圖像處理軟件測定各組氣道壁 MMP-9、TIMP-1、IV型膠原含量(免疫組織化學染色陽性單位)。

1.3 統計學處理

所有計量資料以珋x±s表示，用SPSS17.0統計軟件對統計結果進行分析，各計量數據先進行正態檢驗和方差齊性檢驗，凡符合正態分布和方差齊性的數據，采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD法。對不符合正態分布和方差齊性的計量數據，則進行秩和檢驗(Kruskal– Wallis法)，多組間兩兩比較采用 Mann–Whitney U法。相關性分析采用Pearson法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病理形態學觀察結果

表1顯示，正常組支氣管、肺組織結構正常，各級支氣管上皮完整，肺泡間隔正常，無明顯炎性細胞浸潤。哮喘組氣道黏膜水腫，黏膜皺襞增多，黏膜下及管周有大量的炎性細胞浸潤，氣道上皮細胞脫落，杯狀細胞增多，細支氣管的氣道壁、平滑肌層及基底膜等明顯增厚，管腔變窄甚至閉塞。中藥組和BUD組較哮喘組上述改變明顯減輕。

表1 各組大鼠氣道形態學指標比較(珋x±s，n=10)

2.2 免疫組織化學染色結果

表2圖1顯示，正常組氣道黏膜上皮細胞、少量的間質細胞及極少量的炎性細胞有微量的MMP-9及TIMP-1表達;模型組氣道上皮細胞、氣道炎性細胞及氣道外壁的成纖維細胞和間質細胞均有表達，部分棕黃色呈強陽性表達;中藥組和BUD組較哮喘組顏色變淺，表達明顯減弱。IV型膠原在氣道壁上的表達情況與MMP-9及TIMP的表達趨勢相同。

表2 各組大鼠氣道MMP-9、TIMP-1及IV型膠原表達比較(珋x±s，n=10)

3.3 各組大鼠氣道壁厚度、IV型膠原與MMP-9、TIMP-1的相關性分析

大鼠氣道形態學各指標及IV型膠原含量與MMP-9、TIMP-1呈正相關，與 MMP-9/TIMP-1呈負相關。

3 討論

細胞外基質(ECM)的降解和沉積失衡是導致呼吸道壁結構異常構建、肺實質破壞及間質增生的重要原因，而MMP則是調節ECM代謝的主要限速酶。氣道重構的過程也是MMP在氣道壁沉積的過程，MMPs和TIMPs的平衡是維持ECM內環境穩定的決定因素。國內外研究發現，在MMPs中，MMP-9和 TIMP-1與哮喘氣道壁重構有密切關系［2、4］。

圖1

哮喘氣道重構是哮喘氣道結構改變的簡稱，在形態上主要表現為氣道壁增厚、上皮細胞損傷、基底膜網狀層增厚、黏膜下膠原沉積、支氣管平滑肌增生、血管增生及外膜新血管形成［5］。氣道重構在哮喘的早期或輕型哮喘即存在，并有研究認為它是哮喘發病過程中的一個原發的病理表現［6］。氣道重構導致氣道高反應性、促進氣道炎癥的持續、產生糖皮質激素抵抗及惡化肺功能，有學者認為它可能是頑固性哮喘的病理學基礎［7］。氣道重構一旦發生即難以逆轉，目前認為激素對上皮下纖維化有一定作用，但隨著激素抵抗性哮喘增多，激素加重哮喘氣道重構被報道［8］以及激素的全身副作用被重視，激素的應用面臨挑戰。

中醫認為，哮喘的基本病機是本虛標實證(宿痰內伏、外邪觸發，肺脾腎虛是疾病的關鍵)，止喘湯(黨參、白術、茯苓、甘草、桑白皮、杏仁、葶藶子、黃芩、丹參、川芎)是基于哮喘基本病機證型的復方，由定喘湯合四君子湯加減而成。全方具有補益肺脾腎、活血化瘀、清泄肺熱、祛痰止咳平喘功效，為根據多年臨床經驗研制的自擬中藥合劑，臨床應用效果良好［9］。方中黃芩經實驗研究證實，對哮喘氣道炎癥、氣道高反性［5］和氣道重構［10］有可靠作用。本實驗病理形態學觀察中藥、BUD組均具有干預氣道重構的作用，其中復方組肺纖維化程度要輕于單味組。各組MMP-9、TIMP-1的表達不同，高表達者氣道壁增厚明顯，且MMP-9、TIMP-1的表達及MMP-9/TIMP-1比值與IV型膠原表達、氣道壁厚度之間密切相關。表明中藥、BUD組可能通過抑制MMP-9、TIMP-1的過度表達，調節 MMP-9/TIMP-1的平衡而干預哮喘氣道重構。本實驗研究結果證實，中藥具有干預哮喘大鼠模型氣道重構的作用，這些作用可能是通過抑制MMP-9、TIMP-1的過度表達、調節MMP-9/TIMP-1的平衡而實現的。在療效上基于中醫基本病機證型的復方優于單味中藥，此結果為復方治療哮喘的中醫辨證論治提供了現代實驗室理論依據。

［1］ Holgate ST，Peters-Golden M，Panettieri RA，et al.Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation，smooth muscle function，and remodeling［J］.J Allergy Clin Immunol，2003，111(1 Suppl):S18-34.

［2］ 王光輝，金發光，楚東嶺，等.哮喘豚鼠氣道重構中基質金屬蛋白酶-9及抑制物TIMP-1的表達［J］.第四軍醫大學學報，2006，27(14):1259-1262.

［3］ Tiddens HA，Pare PD，Hogg JC，et al.Cartilaginous airway dimensions and airflow obstruction in human lungs［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，152(1):260-266.

［4］ Atkinson JJ，Senior RM.Matrix metalloproteinase-9 in lung remodeling［J］.Am JRespir Cell Mol Biol，2003，28(1):12-24.

［5］ 鐘南山.支氣管哮喘-基礎與臨床［M］.北京:人民衛生出版社，2006:438-444，891-892.

［6］ Beckett PA， Howarth PH. Pharmacotherapy and airway remodelling in asthma［J］.Thorax，2003，8(2):163-174.

［7］ Homer RJ，Elias JA.Consequences of long-term inflammation Airway remodeling［J］.Clin Chest Med，2000，21(2):331-343.

［8］ 楊艷娜，陳方方，李 洧，等.RSV感染哮喘小鼠氣道炎癥及重構與激素抵抗的研究［J］.山東大學學報 (醫學版)，2008，46(4):335-339.

［9］ 霍博雅，王 慶.平哮定喘湯聯合小劑量糖皮質激素吸入治療支氣管哮喘 142例［J］.中醫雜志，2004，45(2):87.

［10］ 吳世滿，武永杰，劉 麗，等.黃芩苷和川芎嗪對哮喘大鼠氣道壁重構的影響與機制探討［J］.華中科技大學學報(醫學版)，2009，38(4):491-494.