高效陰離子交換色譜測定蜂蜜中葡萄糖和果糖的研究

胡才龍，李 丹，李曉磊

(1.吉林農業大學 食品科學與工程學院食品工程系，長春 130118;2.長春大學 生物科學技術學院食品工程系，長春 130022)

蜂蜜，是昆蟲蜜蜂從開花植物的花中采得的花蜜在蜂巢中釀制的蜜。蜂蜜中含有大量的糖，約占總成分的70% ～80%，其中主要是葡萄糖、果糖。蜜蜂還有多種酶、維生素和礦物質［1］。蜂蜜中的果糖和葡萄糖容易被人體吸收，其具有增強腦力和體力，幫助消化的功能。而且，蜂蜜對腸胃炎、胃潰瘍、創傷和其他疾病有一定的治療作用［2］。因此，蜂蜜中糖分的含量對蜂蜜的品質有著重要意義。

對糖的分析方法有很多種，大致上可以分為兩類:一類是色譜法，另一類是酶學方法［3］。盡管酶學方法非常靈敏和具有高的特異性，但易受到樣品中污染物干擾的限制，而且酶的來源和純化也是一個至關重要的問題，因此色譜法是現在主要的分離檢測糖的方法。用來分析糖類化合物的色譜技術有很多種，包括非常廉價的紙色譜、各種不同的薄層色譜(TLC)、高效薄層色譜(HPTLC)、氣相色譜(GC)、超臨界流體色譜(SFC)、開柱液相色譜和高壓液相色譜(HPLC)等［4］。然而，以上各種色譜分析法都具有各自的缺陷:氣相色譜分析中較煩瑣的樣品處理過程;液相色譜通過柱前衍生然后用紫外和熒光檢測這一方法雖然敏感，但是在定量檢測時常出現異常現象干擾測定;親和色譜中某些糖蛋白寡糖鏈由于高親和性而難于洗脫;毛細管電泳快速、靈敏，但缺乏直接的UV檢測信號。

離子色譜法是近幾年發展起來的儀器分析方法，這種方法不需要對樣品進行衍生化處理［5］。離子色譜法操作簡單，結果準確，是一種快速、便捷的檢測方法［6］，其用于測定糖類逐漸被學者們關注。本實驗以NaOH溶液作為流動相，研究離子色譜法用于蜂蜜中的糖分的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2種蜂蜜(汪氏，長白山)購于沃爾瑪超市;50%NaOH溶液(優級純)購于Alfa Aesar公司;純水機購于摩爾公司;ICS-3000離子色譜儀、CarboPacTMPAl0(4mm×250mm)陰離子交分離換柱、ED3000化學電池購于美國Dionex公司;隔膜真空泵購于天津市騰達過濾器件廠;WH-966漩渦混合器購于江蘇華美生化儀器廠;玻璃塞漏斗、0.45μm 微孔濾膜。

1.2 基本原理

1.2.1 分離原理

中性糖類為pKa在12～14之間的弱酸，電離程度不佳。但在高pH值的淋洗液中，它們會部分或全部以陰離子形式存在，可以與陰離子交換柱上的OH－發生交換而產生吸附作用［7］，延遲糖分子流出的時間，從而達到與其它未能發生交換的組分發生分離的效果。

同時，糖陰離子與陰離子交換柱的吸附作用還與OH－的濃度有關。OH－的濃度越大，其吸附力越弱，這樣分離效果就不佳。然而，OH－的濃度不是越小越好。OH－的濃度過小，一方面會影響糖分子的電離，另一方面，糖分子流出的過慢，會造成圖譜中圖譜峰變形。而且，不同的糖分子對不同的OH－的濃度的敏感性也不同。因此，分離不同的糖分要選擇合適的OH－的濃度。

1.2.2 檢測原理

離子色譜法檢測糖主要使用金電極的脈沖安培檢測器，檢查方法是積分安培法。積分安培法是采用一定的電位—時間波形，將施加電位周期性地加到工作電極上。本實驗脈沖安培檢測器的電流積分時間表和電位施加波形圖分別如表1和圖1。當施加一個電位在金電極上，糖易在金電極表面發生氧化反應，從而產生電信號。在堿性條件下，用金電極檢測糖非常靈敏，可檢測pmol/L的糖，而且不需衍生反應和復雜的樣品純化處理。另外，因為糖氧化產物能對電極產生不可逆的污染，所以施加交換電動勢，從而達到對電極的保護。因此，每個波形包括兩個主要部分:檢測部分和電極表面的重新復原的清洗部分。

表1 電流積分時間表

圖1 電位施加波形圖

1.3 方法

1.3.1 標準樣品的配制

配制0.1mg/ml的葡萄糖溶液和果糖溶液:稱取10mg葡萄糖和果糖分別溶于1ml的蒸餾水中，溶解，渦旋混勻。再稀釋100倍，用0.45μm微孔濾膜過濾待測。

1.3.2 樣品的處理

用電子天平分別稱取0.1106g汪氏蜂蜜樣品和0.1223g長白山蜂蜜樣品，分別定容至100mL，再稀釋10倍，然后各取1mL用0.45μm微孔濾膜過濾，制成待測樣品。則該待測樣品溶液的濃度分別為0.1106mg/mL 和0.1223mg/mL。

1.3.3 色譜條件及測定方法

分離柱:CarboPacTMPAl0(4mm×250mm)陰離子交換柱;淋洗液:150mmol/L NaOH溶液;流速:1.0mL/min;進樣量:25μL;柱溫:30℃;再生液:200mmol/LNaOH溶液;脈沖安培檢測，峰高定量。

2 結果與討論

2.1 標準樣品的色譜圖

標準樣品在CarboPacTMPAl0(4mm×250mm)陰離子交換柱分離得色譜圖，如圖2。可看出在淋洗液為18mmol/mL NaOH溶液、流速為1.0mL/min的條件下，葡萄糖和果糖的保留時間分別為10.67min和12.75 min，其面積分別為170.7276nC*min 和110.9707nC*min。

圖2 葡萄糖和果糖色譜圖

2.2 蜂蜜糖分的測定

待測蜂蜜樣品在CarboPacTMPAl0(4mm×250mm)陰離子交換柱分離得色譜圖，如圖3。其中汪氏蜂蜜中的葡萄糖和果糖面積分別為145.4705nC*min和115.7193nC*min，長白山蜂蜜中的葡萄糖和果糖面積分別為163.5408nC*min 和110.1852nC*min。

圖3 二種蜂蜜樣品色譜圖

2.3 蜂蜜中糖含量的計算

本實驗利用外標法進行計算，蜂蜜中主要糖分為葡萄糖和果糖，其結果如表2。

表2 蜂蜜中葡萄糖和果糖含量結果

3 結論

用離子色譜測定蜂蜜中的糖分，其有以下優點:(1)操作簡單，結果準確，是一種快速測定蜂蜜中糖分的方法;(2)葡萄糖和果糖是同分異構體，用傳統的高效液相－氨基柱，分離效果不好，而離子色譜能彌補這一缺陷;(3)本實驗用的是水和NaOH溶液，這與液相色譜用水、甲醇和乙腈相比，既無毒又經濟;(4)PAD檢測器具有非常高的靈敏度，低至pmol級的糖類也可得到很好的檢測，節約樣品。由于以上優點，其將在蜂蜜質量檢測中發揮著重要作用。

［1］余娜，周光明，朱娟.離子色譜法檢測蜂蜜和葡萄酒中的蔗糖、葡萄糖和果糖［J］.食品科學，2010，31(16):188－191.

［2］Amy E.Jeffrey，Carlos M.Echazarreta.Medical uses of honey［J］.Rev Biomed，1996(7):43 －49.

［3］劉慶生，張萍，范志影.離子色譜法檢測糖［J］.Modem Scientific Instrtunent，2005(1):75 －78.

［4］牟世芬，李宗利.陰離子交換分離－脈沖安培檢測分析糖類化合物的進展［J］.色譜，1995，13(5):320－324.

［5］李超，王俊儒，季曉暉，等.天麻多糖的分離及其單糖組成分析［J］.中國農學通報，2008，24(7):89－92.

［6］王寶蓮，張振清，阮金秀.氨基酸－糖混合物的高效陰離子交換色譜－積分脈沖安培檢測方法的研究進展［J］.國外醫學藥學分冊，2006，3(33):215 －223.

［7］Cai Y，Liu J，Shi Y，et al.Determination of several sugars in serum by high-performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection［J］.J chromatogr A，2005，1085(1):98 －103.