FAT10基因表達與結直腸癌患者臨床病理因素及預后的關系

劉 蓓 王 瓊 范 軍 賀玉娟 付 軍 孫幼芳 曾桃英

FAT10基因表達與結直腸癌患者臨床病理因素及預后的關系

劉 蓓 王 瓊 范 軍 賀玉娟 付 軍 孫幼芳 曾桃英

本文2010—11—05收到，2011—01—16修回，2011—03—11接受

結直腸癌（CCT）是最常見的惡性腫瘤之一。在消化道腫瘤中，其發病僅次于胃癌和食管癌而居第三位，在全球的發病率和死亡率呈上升趨勢［1］。有研究報道，我國CCT也是由低發趨向于高發，統計資料顯示，我國2005年CCT發病數和死亡數分別達17.2萬和9.9萬，已超過美國［2］。FAT10（Diubiquitin，雙泛素）基因是近年來發現的與多種腫瘤的發生和發展密切相關的腫瘤相關基因，由165個氨基酸殘基組成，屬于泛素蛋白家族中的泛素樣修飾蛋白（UBLs），分子量18 KD，由兩個泛素樣部分前后融合而成，它的N端有29%、C端有36%與泛素相同［3，4］。FAT10參與各種基本的細胞行為，包括信號轉導、蛋白易位、細胞凋亡和細胞周期調控［5，6］。近來研究發現FAT10的表達上調參與了腫瘤的發生發展。Lee等［7］研究發現FAT10在肝癌、宮頸癌、卵巢癌等腫瘤組織中表達上調，提示FAT10在腫瘤發生、發展中起著重要的作用。本研究通過檢測CCT樣本FAT10基因m RNA的表達，分析FAT10表達與CCT患者臨床病理資料之間的關系，旨在為CCT的預防、早期診斷提供理論依據，并為基因治療提供新的靶分子。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集我院2000年5月31日～2003年5月31日CCT組織標本73例，患者年齡23歲～85歲，平均年齡55±6.8歲。按照2003年國際抗癌聯盟（UICC）和美國腫瘤聯合會（AJCC）聯合制定的TNM分期法和改良DUKES分期法對CCT患者進行臨床分級，其中臨床分級I期和II期患者共39例，III期和IV期患者共48例，詳細臨床資料見表1。同時收集相同患者癌旁組織（TCT）和正常結直腸組織（NCT），所收集標本均在手術切除后30min內采集，隨后迅速保存于液氮中備用。以上所有標本均經病理組織學確證。

1.2 組織總RNA提取

分別取適量保存于液氮中的CCT、TCT和NCT，在液氮中研磨成粉末狀后，按照TrizolTM試劑盒（MBI公司）操作說明采用氯仿異丙醇法提取組織總RNA。所提取總RNA用適量無RNase去離子水充分溶解后，保存于—70℃備用。

1.3 RT-PCR

取適量提取的CCT、TCT和NCT總RNA，按照逆轉錄試劑盒（MBI公司）操作說明逆轉錄為cD-NA后，進行PCR擴增FAT10基因，擴增引物為：Forward-Primer 5'-AAA CAC AGC AAT CCA GGC A-3'，Reverse-Primer 5'-CCC GTC TTA GTC TCG ATC ATT-3'。以GAPDH為內參照，其擴增引物為：Forward-Primer 5'-ATG CTG GCG CTG AGT ACG T-3'，Reverse-Primer 5'-TGG TCG TTG AGG GCA ATG-3'。以上引物均由上海生物工程有限公司合成，擴增片段大小分別為474bp和652bp。PCR擴增反應條件：95℃3min，94℃30s，56℃45s，68℃30s，共27個循環，最后68℃10min。PCR反應結束后，取適量PCR產物于2.0%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并攝像，然后進行灰度掃描，分析擴增片段灰度值，以FAT10表達灰度值與GAPDH表達灰度值比值為縱坐標，比較FAT10在CCT、TCT和NCT中的相對表達量。

1.4 統計學處理

以陽性率（%）計數FAT10 m RNA在CCT中的表達情況，采用Chi-square檢驗或Fisher確切概率法分析不同臨床資料之間的差異。以均數±標準差（±s）表示FAT10 mRNA在CCT中的相對表達量，采用t檢驗分析FAT10 mRNA相對表達量在不同臨床資料之間的差異。生存率采用Kaplan—Meier法計算，生存期差別的比較采用Log-Rank（Mantel-Cox）時序檢驗。以上所有統計學分析均采用SPSS11.0統計學軟件進行處理。

2 結 果

2.1 FAT10在CCT組織中的表達

提取CCT總RNA后，紫外分光光度計測定其A260／A280，其比值在1.8～2.0之間，說明提取的總RNA質量良好。RT-PCR后2.0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，FTA10 m RNA在73例CCT、TCT和NCT中有不同程度的表達（圖1A）。進一步分析FAT10相對表達量，發現在CCT中的相對表達量（0.664±0.042）明顯高于 TCT（0.525±0.037）（P＜0.05），而TCT中的FAT10相對表達量明顯高于 NCT（0.377±0.029）（P＜0.05）（圖1B）。

圖1 FAT10 mRNA在CCT組織中的表達

2.2 各種臨床病理因素對FAT10陽性表達的影響

本研究收集的73例CCT標本中，6例因臨床資料不完善而不進行此次分析。67例CCT患者詳細臨床資料與FAT10陽性表達情況見表1。分析發現，FAT10在CCT的陽性表達率為52.24%（35／67），其中有淋巴結轉移的CCT的陽性率明顯高于未見淋巴結轉移者（P＜0.05）。TNM分級III＋IV級CCT的陽性表達率明顯高于I＋II級者 （P＜0.05）。CCT患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤臨床進展、分化程度等對FAT10的陽性表達率無明顯影響（P＞0.05）。

表1 各種臨床病理因素對FAT10 mRNA陽性表達率（n，%）的影響

2.3 各種病理因素對FAT10相對表達量的影響

FAT10在有淋巴結轉移的CCT中的相對表達量明顯高于沒有發生淋巴結轉移者（P＜0.01）。TNM分級為III＋IV級CCT患者的FAT10相對表達量明顯高于I＋II級（P＜0.01）。而CCT患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤臨床進展、分化程度等對FAT10的相對表達量無明顯影響（P＞0.05）。

表2 多種臨床病理因素對FAT10 mRNA相對表達量的影響（±s）

表2 多種臨床病理因素對FAT10 mRNA相對表達量的影響（±s）

臨床病理因素 FAT10 mRNA陽性例數 相對表達量t P 值年齡（歲）＜50 8 0.59±0.04 1.79 ＞0.05≥50 27 0.62±0.03腫瘤大小（cm）＜5 15 0.60±0.04 0.45 ＞0.05≥5 20 0.60±0.02腫瘤進展早期 8 0.63±0.03 1.48 ＞0.05中晚期 27 0.62±0.04分化程度高分化或中分化 6 0.57±0.03 1.04 ＞0.05低分化或未分化 29 0.58±0.02淋巴結轉移有27 0.70±0.03 14.38 ＜0.01無8 0.52±0.02遠處轉移有11 0.63±0.02 1.30 ＜0.05無24 0.61±0.03 TNM分級I＋II 8 0.54±0.04 8.48 ＜0.01 III＋IV 27 0.67±0.03

2.4 FAT10表達與術后生存率的關系（Kaplan-Meier生存分析）

截止到2010年4月，67例CCT患者均有5年以上完整隨訪資料。31例CCT患者在術后5年隨訪期間死于CCT復發。FAT10表達陰性患者平均生存期為49.4月，而FAT10表達陽性患者的平均生存期為29.7月，后者明顯低于前者，兩組生存率差異顯著（Chi-square＝7.21，P＜0.05）。見圖2。

圖2 FAT10 mRNA表達與CCT患者生存時間的關系

3 討 論

FAT10屬于泛素蛋白家族中UBLs家族的成員之一，許多上皮源性腫瘤中表達上調，在細胞分裂前、中期通過干擾著絲粒的定位導致細胞染色體不穩定性增加［8］。FAT10主要在胞核中表達，提示其有可能通過參與細胞周期的調節而參與腫瘤的發生、發展［9］。

Caroline等［10］研究發現90%肝癌患者FAT 10蛋白表達水平上調，同時，FAT 10蛋白表達水平在胃癌、CCT等胃腸道腫瘤及婦科生殖系統腫瘤中也上調。Lim等［11］研究發現FAT10 mRNA在結腸癌、肝癌等細胞系中表達上調，在胃癌、結腸癌等胃腸道腫瘤及婦科生殖系統腫瘤中也上調，這種表達上調主要出現在處于細胞周期的S細胞，提示FAT 10可能通過調節細胞周期G2／M期促進腫瘤細胞的生長。

本實驗采用RT-PCR方法檢測CCT中FAT10 mRNA的表達，發現CCT組織FAT10 mRNA的陽性表達率為52.24%，明顯高于NCT和TCT，與有關報道［2］相一致，提示FAT10在CCT的發生發展中可能起著重要的作用。進一步分析發現，FAT10的陽性率與CCT淋巴結轉移及CCT TNM分級有關，而與腫瘤大小、大體類型和分化程度無顯著關系，提示FAT10參與了CCT的局部轉移，說明FAT10可能與CCT的發生、發展密切相關。

分析FAT10的表達與CCT患者生存期之間的關系時發現，FAT10表達陰性患者平均生存期為49.4月，而FAT10表達陽性患者的平均生存期為29.7月，提示FAT10的高表達可能與患者生存相關。進一步進行 Kaplan-Meier生存分析顯示，FAT10表達陽性組生存率明顯低于FAT10表達陰性組（P＜0.05），提示FAT10的表達有可能是CCT患者預后監測的指標之一。

通過對FAT10基因的深入研究，探討其在CCT發生、發展中的作用，提示FAT10有可能成為CCT一個新的腫瘤標志物而用于CCT的預后監測。關于FAT10在CCT中的發生機理、診斷及預后價值、治療作用等尚需進一步研究。

本文第一作者簡介：

劉 蓓（1976～），女，漢族，主治醫師，碩士，主要從事腫瘤免疫學方面的研究

1 Smith RA，Cokkinides V，Brawley OW.Cancer screening in the united states，2008：a review of current american cancer society guidelines and cancer screening issues.CA Cancer J Clin，2008，58（3）：161～179.

2 宋 武，何裕隆，蔡世榮，等.結直腸腺癌病理分型的臨床意義及預后分析.中華消化雜志，2009，29（4）：249～253.

3 Ren J，Kan A，Leong SH，et al.FAT10 plays a role in the regu-lation of chromosomal stability.J Biol Chem，2006，281（16）：11 413～11 421.

4 Schmidtke G，Kalveram B，Weber E，et al.The UBA domains of NUB1L are required for binding but not for accelerated degra-dation of the ubiquitin-like modifier FAT10.J Biol Chem，2006，281（29）：20 045～20 054.

5 Snyder A，Alsauskas Z，Gong P，et al.FAT10：a novel mediator of Vpr-induced apoptosis in human immunodeficiency virus-asso-ciated nephropathy.J Virol，2009，83（22）：11 983～11 988.

6 Gong P，Canaan A，Wang B，et al.The ubiquitin-like protein FAT10 mediates NF-kappaB activation.J Am Soc Nephrol，2010，21（2）：316～326.

7 Lee CG，Ren J，Cheong IS，et al.Expression of the FAT10 gene is highly upregulated in hepatocellular carcinoma and other gas-trointestinal and gynecological cancers.Oncogene，2003，22（17）：2 592～2 603.

8 Zhang，SH，Xu，AM，Chen，XF，et al.Clinicopathologic signif-icance of mitotic arrest defective protein 2 overexpression in hep—atocellular carcinoma.Hum Pathol，2008，39（12）：1 827～1 834.

9 Ross MJ，Wosnitzer MS，Ross MD，et al.Role of ubiquitin-like protein FAT10 in epithelial apoptosis in renal disease.J Am Soc Nephrol，2006，17（4）：996～1 004.

10 Oliva J，Bardag-Gorce F，French BA，et al.Fat10 is an epige-netic marker for liver preneoplasia in a drug—primed mouse mod-el of tumorigenesis.Exp Mol Pathol，2008，84（2）：102～112.

11 Lim CB，Zhang D，Lee CG.FAT10，a gene up-regulated in va-rious cancers，is cell-cycle regulated.Cell Div，2006，1：20.

FAT10基因表達與結直腸癌患者臨床病理因素及預后的關系

劉 蓓，王 瓊，范 軍，等／武漢科技大學附屬天佑醫院病理科，武漢430064

目的：探討結直腸癌（CCT）組織中FAT10（Diubiquitin，雙泛素）的基因表達與其病理因素及預后的關系。方法：收集我院2000～2003年73例有5年以上完整隨訪資料的結直腸癌術后患者，采用RT-PCR方法檢測FAT10 mRNA在CCT、癌旁組織（TCT）和正常結直腸組織（NCT）中的表達情況，并分析臨床病理因素對FAT10陽性表達率和相對表達量的影響，以及FAT10表達與預后的關系。結果：FAT10 mRNA在CCT陽性表達率為52.24%（35／67），且在CCT的相對表達量（0.735±0.034）明顯高于 TCT（0.561±0.044）和 NCT（0.397±0.028）（P＜0.05）；FAT10 mRNA的陽性表達率及相對表達量受臨床進展、淋巴結轉移和TNM分級的影響較明顯（P＜0.05），而患者年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度等對其無明顯影響（P＞0.05）；Log-Rank檢驗顯示CCT患者中，FAT10表達陽性者生存率明顯低于FAT10表達陰性者（P＜0.01）。結論：FAT10在CCT的表達狀況與CCT轉移及預后關系密切，可以作為反映生物學行為和判斷預后的有效指標。

Analysis the Relatvie of FAT10 Expression with Clinico-pathological Features and Prognosis of Colorectal Canc-er

Liu Bei，Wang Qiong，Fan Jun，et al／Department of Pathology，Affiliated Tianyou Hospital of Wuhan Uni-versity of Science and Technology，Wuhan，430064

FAT10 gene；Colorectal cancer；Prognosis

R364.3

A

1005—1740（2011）02—0019—04

武漢科技大學附屬天佑醫院病理科，郵政編碼 武漢430064；通訊作者：曾桃英，E-mail：liubei1976＠126.com，Tel：027-51164947

Objective：To investigate the relationship between expression of FAT10 in colorectal cancer and its clinicopathologic significance.Method：Collected 73 cases in 2000～2003 in our hospital over 5 years follow-up data complete the colorectal cancer patients using RT-PCR to detect FAT10 mRNA expression in colorectal cancer tissues and tumor adjacent tissue，the normal colon tissue as control，and relation of FAT10 expres-sion with clinicopathological features and clinical outcomes of colorectal cancer patients were analyzed.Results：The intensive positive rate of FAT10 mRAN expression in colorectal cancer was 52.24%（35／67）.Ex-pression of FAT10 was significantly correlated with lymph node metasta-sis and clinical stage and TNM staging（P＜0.05），but not with age，tumor size and tumor differentiation，etc.（P＞0.05）.In the intensive positive rate of FAT10 expression in colorectal cancer，the survival rate was significantly lower than negative ones（P＜0.01）.Conclusion：Over-expression of FAT10 in patients with colorectal cancer enhances the pos-sibility of invasion and metastasis，implying a poor prognosis.FAT10 may serve as fairly a good prognostic factor to indicate biologic behavior and prognosis in colorectal cancer.

FAT10基因 結直腸癌 預后

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