高糖培養人腎小球系膜細胞對TGF-β1、FN、Smad7表達的影響

洪 練 李 競 高 凌 陳紅敏

高糖培養人腎小球系膜細胞對TGF-β1、FN、Smad7表達的影響

洪 練 李 競 高 凌 陳紅敏

本文2010—12—14收到，2011—03—02修回，2010—03—04接受

糖尿病腎病（Diabetic Nephropathy，DN）是糖尿病最常見的微血管并發癥，是導致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因［1］，雖然糖尿病患者的高血糖、高血脂、高血壓有很多好的治療控制方法，但DN的發病率仍然居高不下。因此，研究DN的發生機制和治療方案是臨床亟待解決的問題。Smad蛋白是目前唯一所知的轉化生長因子—β1（TGF-β1）的 胞 內 信 號 轉 導 因 子［2］，Smad7 是TGF-β1／Smad信號轉導途徑的負反饋調節因子，在DN的發病過程中，Smad7的表達失衡可能是致病環節之一。本文通過體外實驗，觀察高糖狀態下TGF-β1、纖維連接蛋白（FN）增多的同時，Smad7表達的變化，探討Smad7在細胞外基質（Extracellular Matrix，ECM）沉積中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

FN、TGF-β1 ELISA試劑盒購自中國博士德公司；逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒由立陶宛Fer-mentas公司提供；Smad7多克隆抗體、β-actin兔抗人多克隆抗體由美國Santa Cruz公司出品；辣根過氧化物酶（HRP）標記抗羊抗兔二抗，NC膜、RIPA裂解液、PMSF、凝膠試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、封閉液、一抗二抗稀釋液、ECL Plus化學發光試劑盒均為碧云天公司產品；TGF-β1、FN、GAPDH 引物由上海生工合成；T Personal型PCR儀由德國Biometra公司生產；Gel Doc2000凝膠成像掃描分析系統由美國Biorad公司出品。

1.2 細胞培養和分組

人腎小球系膜細胞（HMCs）購自中南大學湘雅醫學院，以含15%的胎牛血清及含青霉素和鏈霉素（100μg／L）的DMEM 低糖（5.6mmol／L）培養基，置37℃孵箱（5%CO2）培養，2～3天換液1次。按0.3×106／孔密度將上述細胞均勻接種于6孔培養板中，80%融合后換無血清DMEM低糖培養基繼續培養24h以同步化細胞，作為低糖培養對照組；隨后換30mmol／L高糖培養基繼續培養24h、48h、72h，分別為高糖培養24h組、48h組和72h組，后分別收集上清液并提取蛋白、RNA；—70℃保存備用。

1.3 RT-PCR檢測 TGF—β1、FN、Smad7mRNA表達

Trizol試劑盒一步法提取各組細胞總RNA，取2μg，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，取1μl逆轉錄產物，應用特異性 TGF-β1、FN、Smad7及 GAPDH 引物行PCR擴增。TGF-β1引物：上游引物5’-GGT GGA AAC CCA CAA CGA A-3’，下游引物5’-CTA AGG CGA AAG CCC TCA AT-3’，終產物為321bp。Smad7引物：上游引物5’-AGC AGG CCA CAC ACT TCA AACT -3’，下游引物 5’-CAC GTT GTC TCC CCA TCT G-3’，終產物為375bp。FN引物：上游引物5’-TAG CCC TGT CCA GGA GTT CA-3’，下游引物5’-CTG CAA GCC TTC AAT AGT CA -3’，終產物為346bp。GAPDH引物：上游引物5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’，終產物為452bp。TGF-β1反應條件：94℃預變性5 min，然后94℃30s、58℃30s、72℃50s循環35次，最后72℃延伸10 min；Smad7反應條件：94℃預變性5 min，然后94℃40 s、56℃30s、72℃50s循環35次，最后72℃延伸10 min；FN反應條件：94℃預變性5 min，然后94℃30s、60℃30s、72℃50s循環40次，最后72℃延伸10 min。PCR產物以2.0%瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠電泳圖像掃描分析系統進行分析，以目的基因片段與GAPDH片段的條帶灰度比值表示相對含量。

1.4 ELISA檢測 TGF—β1、FN蛋白表達

收集培養不同時間的HMCs上清液，依照試劑盒說明的方法測定其TGF—β1、FN濃度。每份標本均設3個復孔，以其均值代表實驗數值。

1.5 Western blotting檢測Smad7蛋白表達

用BCA蛋白質分析試劑盒測定總蛋白濃度。取總蛋白75μg經12%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用麗春紅染色觀察轉移效果并標示相對分子量標準。然后用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1h。洗膜后加入Smad7抗體（1∶800稀釋），4℃過夜。再用辣根過氧化酶標記的羊抗兔多抗（1∶5000稀釋）雜交1h；洗膜后加ECL（增強化學發光），最后將硝酸纖維膜放入X線片暗盒，壓片、顯影、定影。用分析系統軟件對條帶進行定量分析，測定雜交條帶的吸光度。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 高糖培養 HMCs不同時間對 TGF-β1、FN、Smad7 m RNA表達的影響

本試驗中所提取RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，28S、18S、5S清晰可見，A260／A280在1.8～2.0，提示所提RNA結構完整，純度較高。各組TGF-β1、FN mRNA表達結果見表1、圖1和圖2。統計學分析表明，高糖培養各組TGF—β1、FN mRNA表達均較低糖對照組顯著升高（P＜0.01）；TGF-β1 mRNA表達在培養48h達到高峰；FN mRNA表達隨著高糖培養時間的延長而逐漸升高。Smad7 mR-NA表達結果見表1和圖3。隨著高糖培養時間的延長，Smad7 mRNA表達較低糖對照組下降，從48h開始兩者差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 高糖培養HMCs不同時間后TGF—β1、FN、Smad7 mRNA的表達結果（灰度比值，±s，n均＝3）

表1 高糖培養HMCs不同時間后TGF—β1、FN、Smad7 mRNA的表達結果（灰度比值，±s，n均＝3）

注：與低糖對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組 別 TGF-β1 0.37±0.01 0.40±0.06 0.78±0.12培養24h組 0.64±0.022） 0.78±0.172） 0.64±0.10培養48h組 0.67±0.012） 0.82±0.142） 0.60±0.141）培養72h組 0.64±0.012） 0.91±0.172） 0.59±0.131）FN Smad7低糖對照組

圖1 高糖培養HMCs不同時間對TGF—β1 mRNA表達的影響

圖2 高糖培養HMCs不同時間對FN mRNA表達的影響

圖3 高糖培養HMCs不同時間對Smad7 mRNA表達的影響

2.2 高糖培養 HMCs不同時間對TGF—β1、FN蛋白濃度的影響

與低糖對照組相比，高糖各組TGF-β1、FN蛋白濃度均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；TGF-β1在48h到達高峰，FN濃度隨培養時間延長而升高。見表2。

表2 高糖培養HMCs不同時間后TGF—β1和FN蛋白濃度變化（±s，n均＝3）

表2 高糖培養HMCs不同時間后TGF—β1和FN蛋白濃度變化（±s，n均＝3）

注：與低糖對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01

組 別 TGF-β1（pg／ml） FN（ng／ml）低糖對照組274.48±10.28 44.13±2.29培養24h組 316.07±27.202） 95.57±10.912）培養48h組 324.40±16.892） 166.74±16.342）培養72h組 314.23±19.771） 236.94±13.202）

2.3 高糖培養HMCs不同時間對Smad7蛋白表達的影響

與低糖對照組比較，高糖培養各組Smad7蛋白表達均下降，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）見圖4。

圖4 高糖培養HMCs不同時間對Smad7蛋白表達的影響

3 討 論

DN是糖尿病微血管并發癥之一，也是尿毒癥的主要病因之一。腎小球ECM累積所致的腎小球硬化對DN患者腎功能衰竭的進展有著非常重要的意義。FN是ECM的主要組成成分，在正常腎組織中主要分布于腎小球系膜區，對維持腎小球正常結構起重要作用。Van Det等［3］研究發現葡萄糖濃度升高可刺激HMCs的FN m RNA表達及FN蛋白合成，這種作用通過TGF介導，在很大程度上依賴于內源性 TGF—β1活性的增高，而抗 TGF—β1中和抗體可在蛋白質或mRNA水平逆轉這種效應［4］。研究發現TGF—β1是致腎纖維化的核心因子，參與腎小球硬化的各個環節。活化的TGF-β1可能增加基質蛋白的合成（如膠原蛋白、FN、糖蛋白）和分泌，加強細胞黏附蛋白受體的轉錄、翻譯和處理，減少基質降解蛋白酶的合成，增加這些蛋白酶特異抑制物的合成，從而對組織細胞的形態、增殖和分化過程起到重要作用［5，6］。郭鵬等［7］在糖尿病大鼠模型的 腎小球及腎小管中發現TGF—β1表達較正常組增加；Yamamoto等［8］測定53例不同腎病組織中 TGF—β1 mRNA水平時發現，微小病變腎組織的TGF-β1 m RNA表達與正常組織沒有明顯差異，而以ECM積聚為特征的DN、局灶節段增生性腎小球硬化、新月體性腎小球腎炎等的腎小球TGF—β1 m RNA水平顯著增高。

本實驗通過高糖培養HMCs，發現TGF—β1和FN的mRNA和蛋白表達較低糖對照組顯著增加，這與以上的研究相一致。但Smad7的表達量卻較低糖對照組減少。Smad蛋白是目前唯一所知的TGF-β胞 內 信 號 轉 導 因 子，Smad7 在 TGF—β1／Smad信號轉導通路中起主要的負反饋作用，是細胞中TGF-βⅠ型受體（TβRⅠ）絲氨酸／蘇氨酸激酶的拮抗蛋白，能牢固地與TβRⅠ結合，使之無法將Smad 2／3磷酸化而阻斷信號轉導過程；另一方面，Smad7可阻止TGF-β依賴的Smad 2／4復合體的形成，從而抑制Smad2向細胞核轉運，以減少Smad2介導啟動的FN基因的表達；此外，Smad7還可募集Smad-泛素化調節因子（Smurf l和 Smurf 2）至TGF-β受體，促進TGF-β受體發生蛋白酶降解，從而發揮負調控作用［9］。Hong等［10］在研究db／db小鼠的TGF-β1／Smad信號轉導通路時發現，與對照組相比，TGF-β1及TβRⅡ除在腎小球、腎小管表達增多外，smad2／3蛋白在其細胞漿及細胞核表達也增多，但Smad7表達卻減少。本實驗中HMCs在高糖刺激下，TGF-β1和FN表達增加，而Smad7表達減少，在同樣以纖維化病變為特征的皮膚、肝臟、肺臟疾病中也發現Smad7表達的減少，結合前述的研究成果，筆者認為Smad7表達的減少在一定程度上導致了FN表達的增加，參與了DN的發生。對Smad7在DN中的表達變化進行深入研究，將進一步有助于闡明DN的發生機制，并在此基礎上探尋新的防治DN的措施。

本文第一作者簡介：

洪 練（1985～），女，漢族，碩士研究生，研究方向：糖尿病腎病的發病機制

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3 Van Det NF，Verhagen NA，Tamsma JT，et a1.Regulation of glomerular epithelial cell production of fibronectin and transfor-ming growth factor-βby high glucose，not by angiotensinⅡ.Dia-betes，1997，46（5）：834～840.

4 Sharma K，Jin Y，Guo J，et a1.Neutralization of TGF-βby anti-TGF-βantibody attenuates kidney hypetrophy and the enhanced extracellular matrix gene expression in STZ-induced diabetic mice.Diabetes，1996，45（4）：522～530.

5 尹永紅，趙久陽，呂 申.糖尿病腎病中TGF-β的作用.國外醫學泌尿系統分冊，2005，25（5）：704～707.

6 Border WA，Noble NA.Transforming growth factor beta in tissue fibrosis.New England Journal Med，1994，331（19）：1 286～1 292.

7 郭 鵬，歐陽靜萍，毛先晴.黃芪多糖對鏈唑脲霉素誘導的2型糖尿病大鼠腎臟 TGF-β1表達的影響.微循環學雜志，2007，17（2）：8～10.

8 Yamamoto T，Noble NA，Cohen AH，et al.Expression of transfor-ming growth factor beta isoforms in human glomerular diseases.Kid-ney International，1996，49（2）：461～469.

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10 Hong SW，Isono M，Chen S，et al.Increased glomerular and tu-bular expression of transforming growth factor-beta，its type l receptor，and activation of the Smad signaling pathway in the db／db mouse.Am J Pathol，200l，158（5）：1 653～1 663.

高糖培養人腎小球系膜細胞對TGF—β1、FN、Smad7表達的影響

洪 練，李 競，高 凌，等／武漢大學人民醫院內分泌科，武漢430060

目的：通過觀察高糖對人腎小球系膜細胞（H MCs）轉化生長因子—β1（TGF-β1）、纖維連接蛋白（FN）、Smad7表達的影響，探討糖尿病腎病（DN）的發病機制。方法：將HMCs于高糖（30mmol／L）環境培養不同時間后，采用 RT-PCR方法檢測TGF-β1、FN、Smad7 mRNA 表達，Western blotting檢測Smad7蛋白的表達，采用ELISA檢測TGF—β1、FN蛋白水平，同時以低糖培養作為對照組。結果：高糖培養24h、48h、72h后，TGF-β1mRNA及蛋白的表達均較低糖培養對照組增加，在48h時達到高峰；FN m RNA及蛋白的表達亦較對照組增加，且呈時間依賴性；而Smad7 mRNA及蛋白表達下降。結論：TGF-β1／Smad信號轉導途徑負反饋調節Smad7蛋白的表達減少，可能是DN發病過程中的重要環節之一。

Effect of High Glucose on Transforming Growth Factor-β1，Fibronectin and Smad7 Expression in Human Glomer-ulus Mesangial Cells

Hong Lian，Li Jing，Gao Ling，et al／Department of Endocrinology，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060

Diabetic nephropathy； TGF-β1； Fibronectin；Smad7；Human glomerulus mesangial cell

R587.2 R692.6

A

1005—1740（2011）02—0013—04

武漢大學人民醫院內分泌科，郵政編碼 武漢430060； 通訊作者：李 競，E-mail：lijing7823＠hotmail.com

book=2011,ebook=19

Objective：To explore the effect of high glucose on transforming growth factor-β1（TGF-β1），fibronectin（FN）and Smad7 expression in hu-man glomerulus mesangial cells（H MCs）.Method：HMCs were grown in DMEM medium containing 30mmol／L high glucose for some time（24h，48h，72h）.The expression of TGF-β1，FN，Smad7 mRNA were detected by RT-PCR and western blotting were used to detect the expression of Smad7 while the supernatant level of TGF-β1 and FN were detected by ELISA.Results：In HMCs induced by high glucose，the mRNA and pro-tein expression of TGF-β1 were improved and come to the most after 48h，the mRNA and protein expression of FN were up-regulated in a time-dependent manner，however Smad7 was down-regulated.Conclu-sion：High glucose can stimulate the expression of extracellular matrix excessively，to some degree，it may owe to the reduction of Smad7 which is a major I-Smad in TGF-β1／Smad signaling pathway.

糖尿病腎病 轉化生長因子—β1 纖維連接蛋白 Smad7 人腎小球球系膜細胞／高糖培養