超微粉碎對黃連解毒散中成分溶出的影響

劉永錄,李艷玲,趙玉叢,于 瑞

(1.鄭州牧業(yè)工程高等專科學(xué)校藥物工程系,河南鄭州 450011;2.河南省康星藥業(yè)有限公司,河南鄭州 451464)

超微粉碎目的是通過超微粉碎增大藥物顆粒的比表面積、促進(jìn)溶出、提高生物利用度、從而提高藥效,最終達(dá)到節(jié)省藥材資源的目的[1]。微粉化技術(shù)在中藥材及方劑中的應(yīng)用研究是目前中藥現(xiàn)代化的研究熱點(diǎn)之一。本試驗(yàn)通過對黃連解毒散中主要藥效成分小檗堿、黃芩苷、梔子苷的溶出量和溶出速度進(jìn)行比較,初步探討其溶出特性,為黃連解毒散超微粉體的應(yīng)用與粒徑控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材 黃連解毒散由黃連、黃柏、黃芩和梔子(均購自安徽亳州市)按規(guī)定比例混合而成。黃連解毒散普通粉由粉碎機(jī)粉碎,過80目篩。黃連解毒散超微粉由河南康星藥業(yè)有限公司采用超微粉碎技術(shù)制成,過400目篩。

1.2 儀器 Waters液相色譜儀和Waters.2487雙波長UV檢測器(美國Waters公司)、BS-210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)、超微粉碎機(jī)(開封市同創(chuàng)超細(xì)粉體工程技術(shù)開發(fā)中心)。

1.3 試劑 黃芩苷(批號:110715-201016)、梔子苷(批號:110749-220714)和小檗堿(批號:110713-200911)標(biāo)準(zhǔn)對照品(由中國藥品生物制品檢定所提供),甲醇和乙腈為色譜純,H3 PO4和十二烷基磺酸鈉為分析純,水為重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 小檗堿的測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Nova-Pak C18(4.6 mm×250 mm),流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水(30∶70),內(nèi)含 1 g/L十二烷基磺酸鈉,流速1m L/min,柱溫30℃,波長 346 nm。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取小檗堿對照品適量,加甲醇制成200μg/m L溶液,即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液0.5μL,1μL,2μL,5μL,10μL分別進(jìn)樣,按上述色譜條件測定峰面積,以對照品量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程:y=21.973x+28.999,r=0.999 9(n=6),說明小檗堿在10～200μg/m L呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 吸取對照品溶液10μL,重復(fù)進(jìn)樣5次,測定相應(yīng)的峰面積,RSD為0.032%,說明精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品5份,按供試品溶液的制備方法處理后,分別進(jìn)樣10μL,測得小檗堿的含量 14.17 mg/g,結(jié)果 RSD為 1.72%(n=5)。

2.1.6 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品5份,精密加入一定量的小檗堿對照品,按超聲波提取方法分別制備供試品,在上述色譜條件下進(jìn)行測定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果平均回收率為97.6%,RSD為0.65%。

2.1.7 樣品液的制備 樣品液1的制備:取黃連解毒散普通粉和超微粉末適量,精密稱定,置三角燒瓶中,加分析純甲醇30 m L,超聲提取 0.5 h,濾入100m L量瓶中,以分析純甲醇洗滌三角燒瓶和濾渣一并濾入量瓶中,定容至刻度,搖勻,用0.22 m濾膜過濾,即得[2]。

樣品液2的制備:取黃連解毒散普通粉和超微粉粉末約1.0 g,各精密稱定4份,分別置具塞錐形瓶中,加入甲醇 25 m L,密塞,靜置浸泡,分別于 5、10、20、30min時(shí)濾過,量取續(xù)濾液10m L,置25m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.22μm濾膜過濾 ,即得 。

2.1.8 樣品液的測定結(jié)果 吸取樣品液10μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測定,見圖1～3,計(jì)算樣品中小檗堿的含量。結(jié)果見表1～2。

2.2 黃芩苷的測定

2.2.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇∶水∶磷酸(47∶53∶0.2)為流動(dòng)相;檢測波長為280 nm。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對照品適量,加甲醇制成120μg/m L的溶液,即得。

表1 黃連解毒散中3種成分的溶出總量 (mg/g)

2.2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1 μL,2μL,5μL,10μL,20μL分別進(jìn)樣,測定峰面積,以對照品量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程為y=18.446x+66.918,r=0.999 7(n=6),說明黃芩苷在12～240μg/m L呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取黃芩苷對照品溶液分次進(jìn)樣5次,記錄峰面積。計(jì)算平均峰面積,RSD為0.083%(n=5),說明精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品5份,按供試品溶液的制備方法處理后,分別進(jìn)樣10μL,結(jié)果RSD為 1.90%(n=5)。

2.2.6 回收率試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品5份,精密加入一定量的黃芩苷對照品,按超聲波提取方法分別制備供試品,在上述色譜條件下進(jìn)行測定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果平均回收率為97.4%,RSD為0.90%。

2.2.7 樣品液的制備 樣品液1的制備:取黃連解毒散普通粉和超細(xì)粉各0.3 g,精密稱定,加70%乙醇40m L,加熱回流3 h,放冷,濾過,濾液置100m L量瓶中,用少量70%乙醇分次洗滌容器和殘?jiān)?洗液濾入同一量瓶中,加70%乙醇至刻度,搖勻。精密量取1 m L,置10 m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得[3]。

樣品液2的制備:取黃連解毒散普通粉和超微粉粉末約0.3 g,各精密稱定4份,分別置具塞錐形瓶中,加入70%乙醇40 m L,密塞,靜置浸泡,分別于 5、10、20、30 m in 時(shí)濾過 ,量取續(xù)濾液 10 m L,置25 m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.22μm濾膜過濾得供試液。

2.2.8 樣品液的測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL,注入液相色譜儀,見圖4～6,測定即得。結(jié)果見表 1、3。

表3 黃芩苷的溶出速率 (mg/g)

2.3 梔子苷的測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Nova.Pak C18(4.6 mm×250 mm),流動(dòng)相為甲醇∶水(31∶69),流速為1 m L/min,柱溫為30℃,波長為242 nm。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品9.0mg,置50m L容量瓶中加人少量甲醇使其溶解,然后加水至刻度,即得180μg/m L梔子苷溶液。2.3.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1、2、4、6、8m L于5個(gè)10 m L容量瓶中,加甲醇定容至刻度。各進(jìn)樣10μL,按上述色譜條件測定峰面積,以對照品量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),計(jì)算回歸方程為y=20.648x-4.965 7,相關(guān)系數(shù) r=0.999 9,梔子苷在18～180μg/m L呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 吸取對照品溶液10μL,連續(xù)進(jìn)樣5次,測定相應(yīng)的峰面積,RSD為0.083%,說明精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品5份,按供試品溶液的制備方法處理后,分別進(jìn)樣10μL,用外標(biāo)法計(jì)算梔子苷含量,其 RSD分別為1.87%(n=5),表明該法重現(xiàn)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品5份,精密加入一定量的梔子苷對照品,按超聲波提取方法分別制備供試品,在上述色譜條件下進(jìn)行測定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果平均回收率為98.1%,RSD為2.68%,表明該方法可行。

2.3.7 樣品液的制備 樣品液1的制備:取黃連解毒散普通粉和超微粉粉末約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加人甲醇25 m L,密塞,稱定重量,超聲處理0.5 h,放冷,再稱重,用甲醇補(bǔ)足減少的重量,搖勻,濾過,量取續(xù)濾液 10m L,置 25 m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.22μm濾膜過濾即得。

樣品液2的制備:取黃連解毒散普通粉和超微粉粉末約1.0 g,各精密稱定4份,分別置具塞錐形瓶中,加入甲醇 25 m L,密塞,靜置浸泡,分別于5、10、20、30min時(shí)濾過 ,量取續(xù)濾液10m L,置25m L量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,用0.22μm濾膜過濾即得。

2.3.8 樣品液的測定 吸取樣品液10μL進(jìn)樣,按上述色譜條件測定,見圖7～9,計(jì)算樣品中梔子苷含量。結(jié)果見表1、4。

表4 梔子苷的溶出速率 (mg/g)

3 討論

HPLC圖譜顯示,在同一提取方法下,黃連解毒散普通細(xì)粉和超微粉在相同的保留時(shí)間有相同的吸收峰,只是峰值有差別,說明中藥材經(jīng)超微粉碎后沒有新物質(zhì)生成,傳統(tǒng)中藥固有的藥效學(xué)基礎(chǔ)物質(zhì)沒有發(fā)生質(zhì)的變化[4-5]。

表1結(jié)果表明,經(jīng)超聲提取后,黃連解毒散中小檗堿、黃芩苷和梔子苷的溶出量超微粉分別比普通粉高73.44%和115.84%,50.02%,說明中藥經(jīng)過超微粉碎后其中有效成分的釋放量大幅度增加。將有效降低用藥劑量,從而降低成本,節(jié)約資源。表2、表3、表4結(jié)果表明,超微粉比普通粉的溶出速率大大加快,黃連解毒散超微粉碎后,3種有效成分在5min內(nèi)溶出的量均大大超過了普通粉溶出的最大總量。原因歸功于微粉粒徑小,細(xì)胞破壁率高,成分溶出不受細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的阻礙,使得有效成分溶出量增多加快。而隨著時(shí)間的延長,超微粉有效成分溶出的量又有所下降,可能和粒度越細(xì)其靜電吸附力越大[6],反而又把溶出的成分反吸附了有關(guān)。

超微粉碎技術(shù)的應(yīng)用可以使以中藥入藥的傳統(tǒng)劑型-湯劑、散劑、膏劑、丸劑得到改進(jìn)和提高藥效,還可以拓寬以中藥入藥的其他劑型,如片劑、膠囊劑、軟膏劑、吸入劑、涂抹劑等,也可促使先進(jìn)制劑技術(shù)(如固體分散技術(shù)、藥物緩釋技術(shù))在這些中藥劑型中應(yīng)用。此外,在一些固體制劑(如沖劑、片劑、抹劑)中,根據(jù)處方性質(zhì),在制備工藝的某些環(huán)節(jié)引入超微粉碎技術(shù),有可能在溶解度、崩解度、吸收率、附著力和生物利用度方面改善其品質(zhì)。

[1] 孫文格,鄭倩,劉鳳琴,等.中藥超微粉碎技術(shù)及粉體特征的研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè),2009,18(22):75-76.

[2] 國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部)[S].2005:214.

[3] 國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部)[S].2005:211.

[4] 陸付耳,阮金蘭.試論微米中藥[J].世界科學(xué)技術(shù)-中藥現(xiàn)代化,2001(3):12-15.

[5] 何煜,郭琪,杜曉敏.中藥細(xì)胞級微粉碎對體內(nèi)吸收的影響[J].中成藥,1999,21(11):601-602.

[6] 谷麗麗,張雪梅,田莉瑛中藥超微粉碎技術(shù)的應(yīng)用及進(jìn)展[J].生命科學(xué)儀器,2008,6(8):49-52.