吉林地區奶牛乳房炎病原菌分離鑒定與藥敏試驗

尹柏雙,王洪斌,高 利

(1.吉林農業科技學院動物醫學學院,吉林吉林 132101;2.東北農業大學動物醫學學院,黑龍江哈爾濱 150030)

奶牛乳房炎是奶牛最常見、防治最難的疾病之一。它導致奶牛的乳腺功能減退,乳汁分泌減少,奶質下降,嚴重者喪失泌乳功能,是引起奶牛淘汰的主要原因之一,給奶牛業造成了巨大的經濟損失,也危害了人類健康。據統計,世界范圍內奶牛乳房炎的發病率高達50%左右[1]。

雖然抗生素及磺胺類等藥物在乳房炎治療中取得了滿意的效果,但由于各區域氣候環境等因素的不同導致引起奶牛乳房炎的病原菌有所差異,以及長期使用抗生素產生的耐藥性,給奶牛乳房炎的治療帶來困難。因此,及時準確地掌握引起區域內奶牛乳房炎病原菌的種類及耐藥性情況是有效治療該地區奶牛乳房炎的關鍵。

本試驗調查了吉林地區部分奶牛場及散養戶奶牛乳房炎的發病情況,對主要病原菌進行了分離鑒定和藥物敏感性試驗,為該地區奶牛乳房炎的防治提供科學、合理的依據。

1 材料與方法

1.1 試劑 培養基材料:營養肉湯、普通瓊脂和高鹽甘露醇瓊脂均購自北京奧博星生物技術責任有限公司;麥康凱瓊脂(含結晶紫)、伊紅美藍瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司;營養瓊脂購自北京三藥科技開發公司。微量發酵管和藥敏紙片購自上海伊華醫學科技有限公司。魚腥草注射液(河南官渡獸藥制造有限公司);鏈霉素、青霉素、紅霉素、左氟沙星、氧氟沙星、克林霉素、環丙沙星等(吉林農業科技學院提供)。

1.2 乳樣 乳房炎奶樣160份,采自吉林周邊地區奶牛場及部分散養戶飼養的發生臨床型乳房炎而未經抗生素藥物治療的病牛。

1.3 培養基的制備 普通瓊脂培養基、兔鮮血瓊脂培養基、伊紅美藍瓊脂培養基、甘露醇高鹽瓊脂培養基、營養肉湯、麥康凱瓊脂培養基、改良愛德華培養基等,按教材中方法配制。

1.4 乳樣采集 采樣前先用溫水清洗采樣乳頭,再用75%酒精棉消毒乳頭,在每次清洗或消毒乳頭后均用消毒紙巾擦干。棄去采樣奶牛的頭3把奶,然后采集奶汁10～15 m L擠入已做好標記滅菌瓶中,4℃保存,24 h內進行培養鑒定。

1.5 細菌分離與培養 將奶樣搖勻,無菌條件下分別接種于普通瓊脂培養基和血液瓊脂培養基,置于37℃恒溫箱培養,觀察菌落形態,涂片,染色后,鏡檢。根據菌體形態、溶血情況及染色特性初步判定細菌類屬[2]。并將其進一步純化培養,將符合鏈球菌形態特征的菌株接種于改良愛德華培養基;符合葡萄球菌形態特征的菌株接種于血瓊脂平板;符合革蘭陰性桿菌形態的菌株接種于麥康凱瓊脂培養基。

1.6 生化鑒定 根據菌落形態和鏡檢結果,將桿菌接種至肉湯培養基培養24 h,分別進行吲哚、V-P、M.R.、硫化氫、枸櫞酸鹽、過氧化氫酶、糖發酵等試驗鑒定[2]。球菌在普通營養瓊脂和血液瓊脂平板形成圓形、金黃色、灰白色或檸檬色菌落,且接觸酶試驗、凝固酶試驗陽性的細菌,即鑒定為金黃色葡萄球菌;鏡檢形態符合鏈球菌特性,且接觸酶試驗陰性細菌,即鑒定為鏈球菌屬細菌。若細菌CAMP試驗陽性,不水解七葉苷和馬尿酸鈉,即鑒定為無乳鏈球菌;若細菌CAMP試驗陰性,不水解七葉苷和馬尿酸鈉,即鑒定為停乳鏈球菌;若細菌CAMP試驗陰性,水解七葉苷和馬尿酸鈉,即鑒定為乳房鏈球菌[3]。

1.7 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法[4],分別取經鑒定的各培養基上的菌落,作密集劃線分別接種于相應培養基上,夾取抗菌藥物紙片,分別貼于平板上,置37℃恒溫培養24 h后取出,測量抑菌圈直徑,根據抑菌圈的大小,判定藥物的敏感性[5]。

2 結果與分析

2.1 細菌分離結果 從160份樣品中分離出224株細菌,經分離培養、染色鏡檢、生化鑒定等試驗,判定感染病原菌的類型。結果表明,金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌是引起本地區奶牛乳房炎的主要病原菌,占總發病率的82.70%。其他菌共計41株,占18.30%。在160份樣品中只含1種優勢菌的樣品 173份,既單一菌感染的病例占77.23%;含2種及 2種以上菌種的樣品51份,既混合感染的病例占22.77%。

表1 乳樣中細菌檢測結果

2.2 藥敏試驗結果 選用環丙沙星、克林霉素、氧氟沙星、青霉素、魚腥草注射液等11種藥物進行了藥敏試驗。結果表明,各種菌對同一藥物的敏感性多不同,但同一種菌的不同菌株對藥物的敏感程度相似,應用環丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、頭孢曲松鈉、慶大霉素和魚腥草注射液引起該地區奶牛乳房炎的病原菌對其均有較好的抑制作用,該地區奶牛乳房炎的病原菌對青霉素、紅霉素、克林霉素、鏈霉素等有廣泛的耐藥性(表2)。

表2 11種藥物對7種病原菌的平均抑菌直徑(平均值±標準誤)

3 討論

奶牛乳房炎是危害奶牛養殖業最嚴重的疾病之一,奶牛乳房炎發病數量一直居高不下,產生的經濟損失在所有奶牛疾病中居于首位。引起奶牛乳房炎的病原微生物種類繁多,有真菌、細菌、病毒等,但95%以上都是由細菌引起的[6],各地區地理環境及飼養因素的不同導致引起奶牛乳房炎病原菌的種類略有差異。該研究結果表明,導致該地區奶牛乳房炎的病原菌種類主要有表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌。引起致病菌感染病畜的原因主要有兩方面:一方面,是由環境因素引起的,如病原菌通過牛體、泥土、糞便等傳播感染牛只,通過該途徑感染的病菌主要有表皮葡萄球菌、乳房鏈球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等;另一方面,是通過擠奶過程感染,如經擦洗乳房用的毛巾、水等接觸傳播,通過該途徑感染的病菌多為傳染性病原菌,如無乳鏈球菌與金黃色葡萄球菌。因此,保持牛舍內外清潔、牛體的衛生、避免擠奶過程中的交叉感染,是預防奶牛乳房炎的重要措施。

藥敏試驗結果表明,該地區奶牛乳房炎主要病原菌對青霉素、紅霉素、克林霉素、鏈霉素等獸醫臨床常用抗生素產生了較強的耐藥性。環丙沙星、左氟沙星、氧氟沙星、頭孢曲松鈉、慶大霉素和魚腥草注射液對該地區奶牛乳房炎主要病原菌均有較好的抑制作用,可以選用這6種抗菌藥物作為治療本地區奶牛乳房炎的候選藥物。不同地區奶牛乳房炎病原菌對抗生素的敏感性呈現較大差異[7]。純中藥制劑可以有效地治療奶牛乳房炎,解決了抗生素累積的問題[8],因此,本次試驗中選用了魚腥草注射液作為本地區奶牛乳房炎治療的藥物,結果表明,魚腥草注射液對這7種菌產生了很好的抑制作用,因此該藥物可以作為本地區奶牛乳房炎治療的首選藥物。

[1] 周利青.奶牛乳房炎的研究進展[J].畜牧獸醫科技信息,2005,5:8-9.

[2] 東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:132-134.

[3] 魏小娟,蒲萬霞,周緒正,等.蘭州地區奶牛乳房炎病原茵的分離鑒定及藥敏試驗[J].動物醫學進展,2007,28(8):113-114.

[4] 陳坤永,翁良樹,吳慕貞,等.深圳地區奶牛臨床型乳房炎病原菌分離鑒定與藥敏試驗[J].中國獸醫科技,1999,29(9):36-38.

[5] 邱立,張耀相,楊增岐.奶牛乳房炎病原菌的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫,2006(2):63-64.

[6] GILBERT FB,FROMAGEAU A,LAMOUREUX J,et a l.Evaluation of tandem repeats for MLVA typing of Strep tococcusuberis isolated from bovine mastitis[J].BMC Vet Res,2006,2:33.

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[8] 代敏,王雄清,王紅寧,等.綿陽市奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國獸醫雜志,2007,43(3):33-34.