氟對雄性小鼠生殖毒性的試驗

吳培福,曲偉杰,郭愛偉

(1.西南林業大學保護生物學學院,云南昆明 650224;2.云南農業大學動物科學技術學院,云南昆明 650201)

氟是動物生長所必需的元素,適量的氟有利于機體預防齲齒、維持鈣磷代謝和保持神經沖動傳導,但攝入過量的氟可導致機體中毒,引起人和動物機體多系統功能損害,主要表現為氟骨癥和氟斑牙,并對人和動物的健康及經濟帶來了巨大的損害。長期以來,氟中毒的研究主要集中于氟對骨骼、牙齒等骨相組織的損傷,而對非骨相組織的研究很少見到。近年來,隨著氟化物在工農業生產中應用和對氟中毒病的研究,氟對非骨相組織的毒性作用逐漸被人們重視[1]。本試驗采用石蠟組織切片技術、細胞計數等方法,系統地探討了氟對雄性小鼠生殖毒性的作用,為氟致非骨相組織損害的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 試驗所用昆明系小鼠和鼠糧均購自昆明醫學院實驗動物中心;制作切片所用的甲醛溶液(分析純)、丙酮(分析純)、酒精、二甲苯(分析純)、軟蠟和硬蠟均來自本院重點實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠氟中毒模型的建立 選用20只雄性昆明系小鼠,隨機分為4組,分別飼喂含0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L和150mg/L氟化鈉的飲水120 d(用蒸餾水配制)。鼠糧購自昆明醫學院實驗動物中心。根據小鼠牙齒損傷的程度來判斷氟中毒情況。飼喂結束后,處死小鼠并觀察內臟器官的組織病變。1.2.2 睪丸組織切片的制作 參考常規石蠟組織切片流程進行組織切片,即取材、固定、洗滌和脫水、透明 、浸蠟 、包埋 、切片與粘片 、脫蠟 、H.E.染色 、透明和封片觀察。

1.2.3 小鼠精子計數和染色觀察 在試驗的第120天,拉頸處死實驗小鼠,用眼科剪解剖陰囊,取出小鼠睪丸,摘取附睪,在燒杯中剪碎,用100 m L PBS沖洗,然后取上清在細胞計數板上進行常規計數。此外,將新鮮采集的精子立即涂片,空氣干燥,然后進行H.E.染色,顯微鏡觀察,隨機計數200個精子,觀察畸形的精子,并計算畸形精子的比率。

1.2.4 氟中毒致小鼠睪丸細胞凋亡的觀察 用吖叮橙染液對睪丸組織細胞進行染色,水洗,而后在熒光顯微鏡下觀察凋亡情況。

1.2.5 氟對小鼠睪丸細胞染色體損傷的研究 同上摘取小鼠睪丸,將其剪碎,加入0.9%生理鹽水5 m L,再加入蒸餾水5 m L,用膠頭滴管吹打均勻,靜置20 m in,取上清液與冰乙酸和無水乙醇(1∶3)的混合液等量混合,取混合液滴在潔凈的載玻片上,將載玻片在酒精燈上過火1～2次,用姬姆薩染色30 min,水洗,鏡檢。

2 結果與分析

2.1 小鼠氟中毒模型的建立 經過120 d的飼喂,染氟組小鼠出現不同程度的精神委靡、活動減少等中毒情況,牙齒出現明顯的氟斑牙癥狀,表現為大部分牙釉質脫落,牙本質明顯,牙齒表面粗燥、無光澤、透明度差,牙體散在白色斑點或小斑塊,且凹凸不平,有缺損。其中150 mg/L染氟組牙齒的病變最為明顯。氟對牙齒的損害存在劑量效應關系,隨染氟量的增加,牙齒的損傷程度越明顯。對照組小鼠牙齒呈正常表現,牙釉質呈棕黃色半透明,牙表面光滑而富有光澤。此外,染氟組小鼠還表現為:胃黏膜和肝臟周緣有出血點,部分小鼠的腎臟腫大。由以上病變情況可以看出,本試驗成功建立了小鼠氟中毒的模型。

2.2 氟對小鼠睪丸指數的影響 本試驗測定表明,投氟組睪丸指數低于對照組,但氟中毒對睪丸指數沒有明顯的影響。

2.3 氟對小鼠睪丸組織形態結構的影響 在顯微鏡下,染氟組小鼠的曲細精管出現管壁斷裂,結構排列紊亂,生精細胞、次級精母細胞從生精上皮脫落,部分細胞的胞膜破裂。次級精母細胞、精母細胞和生精上皮細胞的核發生固縮,出現凋亡。曲細精管中精子的數量明顯沒有對照組多,且精子相互粘連,交連在一起。氟中毒組發育中的精子細胞出現畸形,形態多樣,且部分精子細胞膜出現破裂。畸形精子具體表現為蜷曲、斷裂、鉤尾等病變。此外,染氟組大量次級精母細胞胞質和胞核中出現空泡樣病變,且有微核出現(見圖 1～3)。

睪丸組織結構的病變程度隨著染氟劑量的增加而加重,其中150 mg/L染氟組睪丸的病變最為明顯。另外,隨染氟量的增加,微核率也相應地增加。

2.4 小鼠精子計數和染色觀察 通過細胞計數,發現氟對小鼠精子有一定的損傷作用,由表1可以看出,隨著氟中毒劑量的增加,精子數量明顯下降。對照組與氟中毒組有顯著的差異(P＜0.05)。

圖3 150 mg/L氟中毒組脫落細胞的微核率增加(100×)

表1 氟對小鼠精子數量的影響

在顯微鏡下,對照組精子形態結構完整,而氟中毒組中精子出現蜷曲、鉤尾、雙頭、小頭、斷裂、頂體脫落、粘連等畸形(圖 4、圖5)。

2.5 氟中毒致小鼠睪丸細胞凋亡的觀察 在熒光顯微鏡下,對照組細胞正常,而中毒組出現凋亡樣細胞,細胞固縮,有明亮的熒光點,其中100 mg/L中毒組最為明顯。150 mg/L氟中毒組中細胞的凋亡量小于100 mg/L中毒組,但出現了大量的死亡細胞,表現為胞核熒光散大。

2.6 氟對小鼠睪丸細胞染色體損傷的研究 對照組細胞的染色體沒有任何異常現象,氟中毒組細胞的染色體出現環形、交換異常等現象。

3 討論

3.1 氟中毒模型的建立 氟中毒一般呈地方流行性,且飲水型氟中毒常呈慢性中毒。本試驗采用給動物投服高氟水的途徑給氟,簡單易行,符合飲水型氟中毒的攝氟途徑。通過試驗分析結果可以看出,給小鼠飼喂高濃度的含氟水3個月,便可引起明顯的氟中毒,這與以往的報道相一致。氟中毒模型建立所需時間的長短與投氟的途徑、氟化物的濃度、采用的試驗動物等有關。如高劑量的氟引起中毒的時間短,不同的動物對氟的耐受性不一樣。

3.2 氟對小鼠睪丸指數的影響 本試驗顯示氟中毒對器官發育上的影響不大,這與以往的研究結果相一致,但王建[2]對雞的研究結果表明,染氟雞體質量、睪丸質量、睪丸質量/體質量均顯著低于對照組,與本試驗不一致。這可能與以下原因有關:染氟劑量不一樣;不同的劑量對組織器官的損傷程度不一樣;投氟時間長短不一樣;動物品種不一樣;不同動物品種對氟的耐受量不一樣。

3.3 氟對小鼠睪丸組織形態結構的影響 睪丸組織主要由生殖細胞、支持細胞和間質細胞組成。睪丸的結構與功能是否正常將會影響精子的質和量。本試驗結果顯示,染氟組睪丸曲細精管結構排列紊亂,生精細胞、次級精母細胞發生脫落,精母細胞胞質和胞核中出現大量的空泡樣病變,細胞的微核率增加,精子出現畸形。Kour研究表明,氟可使小鼠曲精小管退化壞死,精子發育停止[9]。寧可欽和甄炯[3-4]等研究發現,高氟對睪丸組織支持細胞、精子細胞和間質細胞損傷明顯。崔留欣等[5]研究表明,氟致各級生精細胞損傷中,以精子細胞為主。該研究結果的差異,可能與染氟劑量、投氟時間長短、動物品種等有關。

精子的形成與睪丸組織結構的完整性有直接的關系。氟中毒時,睪丸的組織結構受到不同程度的損傷,這不難解釋染氟組精子數量少的原因。此外,氟是一種很活潑的元素,對精原細胞、精子等可能有直接的作用,因而,出現各種畸形和相互的粘連。

3.4 小鼠精子計數和染色觀察 精子數量、形態和活動率是分析雄性生殖功能的重要指標之一。唐前華等[6]研究表明,隨著尿氟逐漸升高,精子數量、精子活動率均較明顯遞減,精子活動力也明顯減弱。本試驗研究結果顯示染氟后,氟組大鼠精子計數、精子活動率均顯著低于對照組,精子畸形率顯著高于對照組,與以往的試驗結果相一致。

3.5 氟中毒致小鼠睪丸細胞凋亡的觀察 有關氟致小鼠睪丸細胞凋亡的報道很少,本試驗表明,氟可引發睪丸細胞的凋亡,且100mg/L時最為明顯。氟引發睪丸細胞凋亡的機理可能與以下因素有關:誘導自由基產生而導致脂質過氧化作用增強;與生殖系統中組織器官細胞膜受損離子通道改變有關;作為酶抑制劑抑制相關酶活性,尤其是二價金屬離子為輔基的酶。

3.6 氟對小鼠睪丸細胞染色體損傷的研究 有關氟的遺傳毒性方面,目前仍有爭議[7-8]。梁玉華等研究表明,高氟可引起染色體斷裂,導致染色體畸變。Tsutsui曾觀察到氟化物可引起培養的敘利亞地鼠胚胎細胞新生物的形態轉化,胚胎細胞的染色體畸變率、姐妹染色單體互換率及程序DNA合成明顯增加[8]。這些研究結果與本試驗一致。氟化物到底是否具有遺傳毒性,還需進一步的研究。

[1] 徐海峰,牛廣明,陳克,等.過量攝入氟化物對多器官損傷的研究[J].內蒙古醫學雜志,2009,41(4):385-388.

[2] 黎曉敏,秦港,王建.實驗性氟中毒雞睪丸組織的病理學研究[J].畜牧獸醫學報,2006,37(7):717-721.

[3] 寧可欽,袁淑德,劉偉,等.慢性氟中毒大鼠睪丸和前列腺的超微結構觀察[J].中國醫科大學學報,1990,19(5):3393-3420.

[4] 甄炯,陳榮安,章孟本,等.氟化鈉對雄性大鼠生殖系統影響的實驗研究[J].工業衛生與職業病,1993,19(4):202-207.

[5] 崔留欣,姜春霞,王錫林,等.氟致雄性大鼠生殖功能損害的實驗研究[J].中國地方病學雜志,2003,22(3):195-197.

[6] 唐前華,孫發.燃煤型氟中毒對人體精子活力的影響[J].醫藥與保健,2009,17(8):84-85.

[7] 張平.氟化物遺傳毒性的研究進展[J].畜禽業,2009,238:42-44.

[8] 周健.氟的生殖、遺傳毒性和對子代健康影響的研究進展[J].現代預防醫學,2008,35(14):2640-2643.