氧化應激調控的神經細胞NF-κB表達

張仁云,李 申,劉 丹,李 潔

(天津醫科大學精神醫學教研室,天津 300070)

帕金森病(PD)是一種常見的中樞神經系統變性疾病,主要病理改變為含黑色素神經元變性丟失,黑質致密部多巴胺能神經元尤為顯著。神經黑色素最初在富含兒茶酚胺能神經元的黑質和藍斑中發現,研究表明在不同的生理條件下神經黑色素可能在 PD發病中起到保護或者毒性作用[1,2]。PD病因至今未明,但氧化應激在細胞變性死亡過程中發揮重要作用這一觀點被普遍接受。NF-κB是一種廣泛存在于體內多種細胞的核轉錄因子,參與多種疾病病理生理、多種基因調控、機體免疫應答和細胞凋亡的信號傳導過程。近年研究發現,NF-κB和PD的發病有關。2008年 12月 ～2009年 10月,我們用芬頓試劑(FR)作為誘導神經元細胞和神經膠質細胞氧化應激的基本條件,在有或者沒有人類神經黑色素(hNM)、多巴胺黑色素(DAM)、鐵螯合劑去鐵胺(DFO)等不同條件下培養細胞,觀察NF-κB mRNA基因表達水平的變化。

1 材料與方法

1.1 hNM的制備 人腦組織來自德國維爾茨堡大學人腦庫,通過中國和德國的倫理委員會批準,供者均沒有神經或者精神疾病。hNM的分離如文獻[3]描述的方法完成。DAM的制備根據Ben-Shachar等[4]的描述進行。

1.2 細胞培養和處理 SK-N-SH是人類神經母細胞瘤細胞系,U373是人類膠質母細胞瘤細胞系,細胞培養的方法如文獻[4]。本實驗的細胞樣本分兩組,即對照組和處理組(FR、hNM、FR+hNM、DAM、FR+DAM、DFO、DFO+FR、DFO+hNM、DFO+FR +hNM、DFO+DAM、DFO+FR+DAM)。hNM樣本的準備是在DMEM中超聲溶解,最終得到均勻的黑色素顆粒懸浮液。將懸浮液加入新鮮培養基中進行培養,使終濃度達到50或100 ng/ml。FR的配制為：400μmol/L FeSO4+200μmol/L H2O2。

1.3 實時定量PCR法檢測NF-κBmRNA的表達所有RNA的提取按照QIAGENR公司的RNA提取試劑盒說明書進行。根據試劑盒說明書,使用由BioRad Laboratories公司的iScriptTMcDNA合成試劑盒,利用引物Oligo-d(T)和random hexamers完成互補DNA(cDNA)第一鏈的合成。最初,我們測定了6個管家基因,包括ACTB、ALAS1、GAPDH、RPS18、RPL13A和PPIA。通過程序geNorm(版本3.3;網址：http：//medgen31.ugent.be/jvdesomp/genorm/)測算出前三個管家基因最穩定,因而選擇它們計算標準化因子。通過實時定量 PCR法對不同方法處理的細胞中NF-κB的cDNA表達進行分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件,數據來自三次獨立的實驗,數據分析使用Microsoft Excel 2000生成原始表達式的值,數據比較進行單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氧化應激誘導的NF-κB mRNA在神經細胞SK-N-SH的表達 與對照組相比,SK-N-SH細胞在經過FR、FR+hNM、FR+DAM處理后,NF-κB的基因表達明顯上升(P均＜0.05)。加入DFO前后兩組相比,僅NM和DFO+hNM未出現明顯變化,其他各組在加入DFO后細胞NF-κB的基因表達均有了明顯降低(P均＜0.05)。與DFO組相比,僅DFO +FR+DAM組NF-κB的基因表達顯著上升(P＜0.05)。FR+DAM組和FR組相比,NF-κB的基因表達顯著上升(P＜0.05)。見圖1。

圖1 NF-κB mRNA在SK-N-SH中的表達

2.2 氧化應激誘導的NF-κB mRNA在神經細胞U373的表達 與對照組相比,U373細胞在經FR+ DAM處理后,NF-κB的基因表達顯著上升(P均＜0.05)。加入DFO前后兩組相比,僅DFO+FR+ hNM組與FR+hNM組,DFO+FR+DAM組與FR +DAM相比細胞NF-κB的基因表達有顯著降低(P均＜0.05)。與DFO組相比,DFO+FR,DFO+ DAM,DFO+FR+DAM組NF-κB的基因表達均有了顯著增高(P均＜0.05)。見圖2。

圖2 NF-κB m RNA在U 373中的表達

3 討論

NF-κB在所有的細胞類型中都有表達,在功能上為一序列特異性轉錄因子[5]。PD患者腦組織研究顯示,NF-κB在黑質紋狀體的含量比正常對照明顯增高。NF-κB反映細胞凋亡和大腦炎癥狀態,并且NF-κB參與了黑質紋狀體多巴胺能神經元的變性過程[6]。

本研究中,FR作為氧化損傷的直接誘導,使得SK-N-SH細胞處于氧化應激的環境,結果顯示NF-κB處于過表達狀態,與Zecca等[7]研究結果一致。hNM本身未能增加NF-κB mRNA的表達,而FR+ hNM使該基因表達明顯上調。這一結果表明,生理條件下,hNM對神經元NF-κB mRNA無影響,而當鐵濃度升高時,誘導了NF-κB mRNA的表達。既往有研究表明,hNM可結合金屬離子特別是鐵離子,以調節細胞內的氧化應激水平[8]。hNM結構中有鐵的高結合位點和低結合位點,生理條件下,細胞內的游離鐵穩定地結合在hNM的高結合位點;但當鐵的濃度升高時,hNM分子中鐵的高結合位點飽和后,鐵與低結合位點不穩定結合,反而導致細胞損傷顯著[3,9]。本研究中,FR+hNM恰好模擬了PD患者黑質中鐵含量增高的環境,超過了hNM的鐵高結合位點的結合能力,因而使細胞處于氧化應激狀態, NF-κBmRNA出現反應性上調。

由于從人腦中分離出hNM量少且困難,大多數功能性研究都是利用人工合成的 DAM來代替hNM。在本研究中DFO+FR+hNM處理組和DFO +FR+DAM處理組神經元細胞NF-κBmRNA的基因表達有統計學差異,說明在體外 DAM不能模擬hNM的生理功能。這和既往研究[3]結果 DAM和hNM之間存在結構上和功能上的差別一致。與 FR組相比,FR+DAM誘導神經細胞NF-κBmRNA的基因表達上出現了明顯改變,說明在有鐵離子存在的情況下,DAM的氧化活性增強,提示DAM在氧化應激條件下可誘導神經元細胞凋亡[10]。

DFO去鐵胺是一種鐵螯合劑,在本實驗中鐵離子被去鐵胺螯合后,NF-κBmRNA在SK-N-SH細胞中的表達顯著下降,與既往研究[3]結果DFO可以明顯減少FR試劑誘導的細胞損傷,而起到神經保護作用一致。在本研究中氧化應激誘導的人類神經膠質細胞NF-κB mRNA的基因表達和對照相比,在DFO+hNM處理組出現明顯減低,這可能與DFO螯合了hNM中的鐵離子,減低了細胞的氧化應激有關。此結果說明在氧化應激條件下,神經膠質細胞可能通過過度表達 NF-κB來抵抗氧化應激造成的損害,起到神經保護作用。

綜上所述,本研究證明,NF-κB在氧化應激條件下在神經元細胞內表達增加,為NF-κB對神經元細胞有保護作用提供了新的證據。NF-κB在神經元細胞和神經膠質細胞內相同條件下基因表達的變化不同,提示這兩種細胞的生物學行為存在差異,神經元細胞可能比神經膠質細胞對氧化應激更為敏感。

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