大蒜素對人肺癌 H460細胞增殖及凋亡的影響

杜亞明,鄭 偉,王中彬＊,劉長軍,蘇 鵬

(1遼寧醫學院附屬第一醫院,遼寧錦州 121001;2武警遼寧省總隊醫院; 3鞍山市第二醫院;4遼陽市中心醫院)

大蒜素具有抗癌、防癌作用[1]。目前,有關大蒜素在消化道腫瘤中的作用研究較多,而在肺癌中的作用研究較少。2010年 4～10月,我們觀察了大蒜素對人肺癌 H460細胞增殖及凋亡的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 H460細胞。大蒜素注射液(12 mg /ml)配制成100 mmol/L的溶液,0℃避光保存; RPMI1640培養液,胰蛋白酶,胎牛血清(FBS),吖啶橙試劑(AO),MTT,Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒。TEHER二氧化碳孵箱,TDGC-2J-1超凈工作臺,Olympus倒置顯微鏡和熒光顯微鏡,流式細胞儀,TGL-16G高速冷凍離心機,G3022酶聯免疫檢測儀,DHG-9030A數顯氣浴恒溫干燥箱。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 H460細胞在完全培養基中培養,2 d換液 1次,至細胞處于對數生長期、長滿培養瓶底面積約80%;用0.25%胰蛋白酶消化傳代,按105/m l接種于 50m l培養瓶中。

1.2.2 大蒜素對 H460細胞增殖作用觀察 采用MTT法。取對數生長期的H460細胞,以1×104/ml接種于96孔板,100μl/孔,置 37℃、5%CO2的培養箱內過夜(6～12 h)。細胞貼壁后,實驗組分別加入12.5、25、50、100μmol/L的大蒜素,并分別培養24、48、72 h,每個濃度、每個時點均設 4個復孔,對照組設1個復孔。終止培養前4 h,每孔加入MTT溶液20μl,繼續培養;終止時吸棄上清液,每孔加入100μl二甲基亞砜(DMSO),微孔板震蕩器上震蕩10min,用酶標儀于570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)。細胞增殖率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 大蒜素對 H460細胞凋亡作用觀察 取對數生長期的 H460細胞,以 5×105/m l接種于 6孔板,2 ml/孔。分別加入0、12.5、25、50、100μmol/L的大蒜素作用24 h,離心后,收集H460細胞;PBS洗滌3次,加入碘化丙啶(PI),避光染色15 min,上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件。數據比較用方差分析和 q檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大蒜素對H460細胞增殖的影響 見表 1。由表 1可見,隨著大蒜素濃度增大、作用時間延長, H460細胞增殖率逐漸降低,呈劑量、時間依賴性(P均＜0.05)。

表1 實驗組不同濃度大蒜素對H 460細胞增殖的影響(±s)

表1 實驗組不同濃度大蒜素對H 460細胞增殖的影響(±s)

大蒜素濃度(μmol/L)細胞增殖率(%) 24 h 48 h 72 h 12.5 93.67±2.18 88.84±2.58 77.12±2.15 25 86.67±0.84 85.01±1.05 74.78±3.59 50 57.89±2.78 46.23±1.63 24.05±3.27 100 43.79±1.48 34.96±2.70 23.23±1.43

2.2 大蒜素對 H460細胞凋亡的影響 大蒜素與H460細胞共培養 24 h后,其濃度為 0、12.5、25、50、100μmol/L時,H 460細胞凋亡率分別為 0.45% ±0.23%、8.54%±1.54%、12.43%±1.95%、29.47%±3.83%、38.69%±6.66%。隨著大蒜素濃度增大,H460細胞凋亡率逐漸升高,呈一定劑量依賴性(P＜0.05)。

3 討論

大蒜素是大蒜特有的含硫化合物,一般被用于抗細菌、病毒和真菌的感染。體外實驗證實,大蒜素能夠直接殺傷腫瘤細胞,或通過調節機體免疫功能干擾腫瘤細胞的生長等途徑而抑制腫瘤發生,而且這種抑制作用對生物體幾乎無不良反應。其抗腫瘤作用可能有以下機制：①阻斷致癌物質的合成[1]：亞硝酸鹽是合成強致癌物亞硝胺的前身物,大蒜可降低胃內亞硝酸鹽含量,從而影響亞硝胺的合成,進而降低患胃癌的幾率[2]。乙烯雌酚(DES)可使人或動物致癌,Green等[3]研究提示大蒜素可直接抑制DES的代謝,從而預防雌激素誘導的腫瘤的發生。②抗氧化作用：研究[4]證實,大蒜素能對抗毒物對機體的氧化性損傷,與其所含的巰基和親電子集團具有清除活性氧自由基作用有關。Thomas等[5]研究證實,大蒜素中的有效成分二烯丙基硫醚(DAS)能有效抑制乳腺組織代謝中DES氧化所導致的細胞基因不穩定和癌變。③直接殺傷腫瘤細胞：哈敏文等[6]研究發現,大蒜素對胃癌 MGC-803、SGC-7901細胞的生長均有明顯抑制作用,且呈劑量依性。④調節機體免疫功能：大蒜素作為一種免疫激發劑,能有效提高NK細胞活性和IL-2水平,增強T淋巴細胞分裂增生及活性[7]。⑤對抗腫瘤藥物的增敏作用和抗耐藥作用：研究[8]發現,適當調整抗癌藥物和大蒜素的劑量,同時增加大蒜素給藥次數,可能使大蒜素發揮很好的增敏作用。推測大蒜素與其他化療藥聯合應用,可增強療效,降低耐藥性。

本研究結果顯示,大蒜素在50～100μmol/L濃度范圍內可顯著抑制人肺癌 H460細胞的生長,而較低濃度(12.5～25μmol/L)的大蒜素對細胞的生長抑制不明顯;隨著大蒜素濃度的升高,H460細胞凋亡率逐漸升高。我們認為,一定濃度的大蒜素在體外對人肺癌 H460細胞有顯著的生長抑制作用,與其細胞周期阻滯和細胞凋亡有關。當然,其確切機制及體內實驗是否有類似結果,有待進一步研究。

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