免疫傳感器在食品真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

韓鵬飛，李洪軍，2，*，鄒忠義

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715;2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715)

免疫傳感器在食品真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

韓鵬飛1，李洪軍1，2，*，鄒忠義1

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715;2.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400715)

真菌毒素污染是造成糧食和食品安全問題的重要因素之一。傳統(tǒng)的分析檢測(cè)技術(shù)如色譜分析法、免疫化學(xué)法等用于真菌毒素檢測(cè)中具有耗時(shí)長(zhǎng)、樣品前處理繁瑣等特點(diǎn)。本文介紹了采用生物免疫傳感器快速檢測(cè)真菌毒素的方法，主要綜述了它們?cè)诟黝惣Z食、食品等基質(zhì)中真菌毒素檢測(cè)的應(yīng)用現(xiàn)狀，并簡(jiǎn)要分析了該技術(shù)存在的不足，對(duì)其應(yīng)用前景做出了展望。

真菌毒素，免疫傳感器，快速檢測(cè)，應(yīng)用，問題

真菌毒素是存在于食品和糧食中能直接引起人或動(dòng)物病理變化或生理變態(tài)的霉菌代謝產(chǎn)物。發(fā)霉很嚴(yán)重的物質(zhì)不一定有較高含量的霉菌毒素，而那些看起來發(fā)霉不嚴(yán)重的材料可能含有大量的霉菌毒素，對(duì)霉菌的研究重心開始轉(zhuǎn)移到霉菌毒素上來，霉菌毒素已經(jīng)成為品質(zhì)評(píng)定的指標(biāo)之一［1］。強(qiáng)化真菌毒素的檢測(cè)力度，直接關(guān)系到保障人們的身體健康和生命安全，也是提高我國農(nóng)副產(chǎn)品國際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要措施。目前真菌毒素的檢測(cè)方法有多種，包括薄層層析法(TCL)、高效液相色譜法(HPLC)、免疫化學(xué)分析法等，但它們都有程序復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)等特點(diǎn)。傳感器技術(shù)正逐漸應(yīng)用于真菌毒素的檢測(cè)中，以其耗時(shí)短，樣品前處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)成為真菌毒素快速檢測(cè)中的新興技術(shù)。

1 免疫生物傳感器的基本原理

免疫傳感器是基于固相免疫分析的生物傳感器，它是一種微型化檢測(cè)裝置，能夠通過抗體選擇性地檢測(cè)待檢物質(zhì)并產(chǎn)生與待檢物質(zhì)濃度相對(duì)應(yīng)的可轉(zhuǎn)換信號(hào)。免疫傳感器作為一項(xiàng)結(jié)合生物學(xué)與物理學(xué)的新技術(shù)而受到青睞。

免疫傳感器的工作原理和傳統(tǒng)的免疫分析技術(shù)相似，即把抗原或抗體固定在固相支持物表面，通過抗原抗體特異性結(jié)合來檢測(cè)樣品中的抗體或抗原。不同的是，傳統(tǒng)免疫測(cè)試法的輸出結(jié)果只能定性或半定量地判斷，一般不能對(duì)整個(gè)免疫反應(yīng)過程的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且所需測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)。而免疫傳感器有能將輸出結(jié)果數(shù)字化的精密換能器，將抗原抗體結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的電學(xué)、化學(xué)、光學(xué)等變化轉(zhuǎn)化成可捕捉信號(hào)進(jìn)行顯示分析，不但能達(dá)到定量檢測(cè)的效果，還有利于對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，同時(shí)縮短了測(cè)定時(shí)間。由于抗原與抗體的特異性強(qiáng)，減少了非特異性干擾，大大提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，同時(shí)擴(kuò)大了檢測(cè)范圍［2］。

2 生物免疫傳感器在真菌毒素檢測(cè)中的應(yīng)用

真菌毒素分子沒有特殊的可供化學(xué)方法直接分析的基團(tuán)，但是大多數(shù)毒素本身具有與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，從而賦予其抗原性，能在體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。以抗體抗原專一性結(jié)合為基礎(chǔ)，加之各種免疫標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使抗體免疫傳感器成為檢測(cè)毒素的有效裝置［3］。目前用于食品真菌毒素檢測(cè)的傳感器種類有電阻抗生物傳感器、熱導(dǎo)率傳感器、電化學(xué)傳感器、壓電免疫傳感器和光免疫傳感器等。

2.1 電阻抗免疫傳感器

Radi［4］等人將電阻抗免疫傳感器用于赭曲霉素A的敏感檢測(cè)。首先通過電化學(xué)還原生成的衍生物在原位4苯甲酸在酸性水溶液中重氮鹽產(chǎn)生了穩(wěn)定的4羧基單層，赭曲霉素A單克隆抗體利用碳二亞胺進(jìn)行固定。赭曲霉素A和固定于傳感器表面的抗體之間的免疫化學(xué)反應(yīng)情況，利用循環(huán)伏安和電化學(xué)阻抗譜進(jìn)行詳細(xì)描述。發(fā)生于免疫傳感器表面的免疫交互作用引起電阻改變，以此來檢測(cè)赭曲霉素A。電子轉(zhuǎn)移電阻值與OTA濃度呈線性正比關(guān)系，檢測(cè)濃度1～20ng/mL，檢測(cè)限為0.5ng/mL。

2.2 熱導(dǎo)率免疫傳感器

Liu等［5］設(shè)計(jì)了一個(gè)新型測(cè)量導(dǎo)熱率的免疫傳感器來檢測(cè)AFB1，他們將辣根末(山葵的根制成的香辛料)過氧化物酶和AFB1抗體分子結(jié)合到功能性金納米微電極上，通過其測(cè)量傳導(dǎo)性來檢測(cè)AFB1。隨后抗體和抗原形成的免疫復(fù)合體作為一個(gè)屏障，阻擋了固定化酶和電極表面接觸，通過毒素濃度的改變其傳導(dǎo)性也發(fā)生相應(yīng)的改變。這種技術(shù)的檢出限為0.1ng/mL。這種免疫傳感器除了免標(biāo)記之外，還能夠小型化和大規(guī)模生產(chǎn)，能夠成為一種方便，性價(jià)比高的檢測(cè)設(shè)備。

2.3 電化學(xué)免疫傳感器

一些真菌毒素的電活性特點(diǎn)使得我們可以利用電化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。Li等研究了一種將黃曲霉毒素氧化酶固定于多層碳納米管上，基于電流測(cè)量的生物傳感器來檢測(cè)AFB1，將黃曲霉毒素氧化酶包埋在溶膠凝膠中，與多層碳納米管改良的鉑金電極相連。AFO和NWCNTs間的共價(jià)鍵維持酶活性并且對(duì) AFB1的氧化做出響應(yīng)。最低檢測(cè)限為1.6nmol/L，平均響應(yīng)時(shí)間為44s［6］。

Nagwa等［7］設(shè)計(jì)了一種電化學(xué)免疫傳感器，該傳感器是建立在間接競(jìng)爭(zhēng)的 ELISA法的基礎(chǔ)上，使用微分脈沖伏安法測(cè)定大麥中的AFB1，檢測(cè)限可達(dá)30pg/mL，且具有較高的回收率。Nancy等［8］采用多層碳納米管改良的玻璃碳電極，將其與連續(xù)流動(dòng)裝置相結(jié)合后制成的免疫傳感器用于玉米中的玉米烯酮毒素檢測(cè)。檢測(cè)過程耗時(shí)15min，其檢測(cè)限和靈敏度都優(yōu)于ELISA方法。

結(jié)合納米技術(shù)的的電化學(xué)免疫傳感器也被研究用于真菌毒素分析檢測(cè)中。Yao［9］等人用改良后的黃曲霉脫毒酶、多層碳納米管建立了一種雜色曲霉素電化學(xué)傳感器。碳納米管具有特定的表層，不僅能夠起到固定大量酶的作用，增加了固定化酶和基質(zhì)反應(yīng)的面具;還能夠促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移，具有高電導(dǎo)性，提高傳感器響應(yīng)度。其檢測(cè)限更寬，并且其LOD比通過 TLC和 HPLC－MS方法得到的要低。Anees［10］等人采用一種納米鋅氧化物平臺(tái)完成了對(duì)真菌毒素的檢測(cè)，將納米鋅氧化物薄膜與銦錫氧化玻璃結(jié)合，共同固定化兔免疫球蛋白單克隆抗體和牛血清蛋白，檢測(cè)赭曲霉素A。X射線的衍射結(jié)果顯示形成的納米氧化鋅顆粒的平均直徑為5nm。傅立葉變換紅外光譜、掃描電子顯微鏡、電化學(xué)阻抗譜用于表征納米氧化鋅/銦錫氧化物電極和牛血清蛋白/兔免疫球蛋白/納米氧化鋅/銦錫氧化物電極。電化學(xué)阻抗對(duì)后者電極的響應(yīng)作為一個(gè)函數(shù)獲得OTA的線性濃度為0.006～0.01Nm/dm3，檢測(cè)限為0.006nm/dm3，響應(yīng)時(shí)間 25s，靈 敏 度 189Ω/nm/dm3· cm－2，回 歸 系數(shù)0.997。

盡管電化學(xué)免疫傳感器具有響應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但樣本的溫度，離子濃度和pH等對(duì)傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性存在一定的影響。

2.4 壓電免疫傳感器

壓電免疫傳感器是將抗原或抗體固定在石英晶體表面，由于免疫反應(yīng)抗原(或抗體)與待測(cè)物中抗體(或抗原)發(fā)生特異性結(jié)合，可引起質(zhì)量的變化，從而引起晶體振蕩頻率的改變，可通過信號(hào)監(jiān)測(cè)器直接讀出，得到待測(cè)物固定前后頻率的變化值ΔF，再根據(jù)Sauerbrey提出的質(zhì)量和頻率的平衡方程ΔF=KF2Δm/A［11］，得到所測(cè)物質(zhì)的質(zhì)量。

壓電裝置(例如石英晶體微量天平)是不需要任何標(biāo)記和分離處理的。Nabok［12］等嘗試用壓電免疫傳感器來檢測(cè)T－2毒素，得到的結(jié)果比理論預(yù)期要好得多。這個(gè)異常現(xiàn)象被認(rèn)為是由于大量疏水的T－2分子(例如膠束)，也可能同時(shí)包裹了甲醇分子，一起作為溶劑。從而能夠成為大分子而被檢測(cè)到。但壓電免疫傳感器存在特異性不高，晶體在使用數(shù)次后不穩(wěn)定等問題，有待進(jìn)一步的研究。

2.5 光學(xué)免疫傳感器(光生物傳感器)

不同的光學(xué)轉(zhuǎn)換方法用于真菌毒素的檢測(cè)中，一些方法(例如熒光)需要一個(gè)標(biāo)記分子，其他(如表面等離子體共振(SPR))僅依靠傳感器表面的質(zhì)量濃度的變化。其原理為通過測(cè)量折射率的變化來檢出毒素，對(duì)分子量在10kDa以上或者具有高折射率的分子能夠直接檢出。目前的研究多集中在研究靈敏度更高的等離子體共振裝置。

2.5.1 表面等離子體共振生物傳感器 表面等離子共振(SPR)技術(shù)在制藥、生物治療和生命科學(xué)研究中的應(yīng)用已經(jīng)有多年時(shí)間，近年在食品分析檢測(cè)領(lǐng)域，例如維生素、獸藥測(cè)試和貝類毒素的檢測(cè)中發(fā)揮了重要的作用。

SPR被用于檢測(cè)B型單端孢霉烯族毒素。Julie P.Meneely等［13］人采用涂有HT－2毒素衍生物和單克隆抗體的傳感器芯片的快速表面等離子體共振檢測(cè)技術(shù)能夠?qū)－2和HT－2毒素進(jìn)行復(fù)合檢測(cè)，HT－2抗體表現(xiàn)出與T－2毒素的高度交叉反應(yīng)，但與其他常見的單端孢霉烯族毒素未見交叉反應(yīng)。

基于表面等離子體共振的間接競(jìng)爭(zhēng)免疫傳感器已經(jīng)用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)［14］和AFB1［15］的檢測(cè)，AFB1檢測(cè)限為3.0ng/mL。對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果與采用色譜分析方法的結(jié)果一致。

Tudos等［16］將酪蛋白與小麥中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)共價(jià)連接制成人工抗原固定在芯片上，通過檢測(cè)溶液中的DON抗體與固相抗原結(jié)合以SPR技術(shù)檢測(cè)反應(yīng)信號(hào)，構(gòu)建了可以對(duì)DON進(jìn)行定量分析的免疫微陣列，最佳檢測(cè)限范圍為2.5～30ng/mL，檢測(cè)結(jié)果與使用氣質(zhì)聯(lián)用(GC－MS)檢測(cè)相一致。檢測(cè)用傳感器可以重復(fù)使用500次，而且不需要復(fù)雜的樣品凈化過程。

JingYuan等［17］人介紹利用表面等離子體共振生物傳感器檢測(cè)谷物和飲料中的赭曲霉素，采用固定于自制單層膜上的微粒子來加強(qiáng)信號(hào)。濃度低至1.5ng/mL的赭曲霉素能夠用這種方法直接檢測(cè)出來。采用納米金粒子(40nm)作為信號(hào)加強(qiáng)能使其檢測(cè)限達(dá)到0.042ng/mL。谷物樣品采用50%甲醇進(jìn)行處理，液體樣品用3%或者5%的聚乙烯吡咯烷酮直接處理，省去了樣品的前濃縮等步驟。燕麥和玉米中的LOD分別為0.3ng/mL和0.5ng/mL。在葡萄酒和其他飲料中的LOD范圍0.058～0.4ng/mL。

2.5.2 其他光學(xué)免疫傳感器 對(duì)于小分子物質(zhì)的檢測(cè)，基于全內(nèi)反射橢圓偏振技術(shù)(total internal reflection ellipsometry，TIRE)的光學(xué)檢測(cè)技術(shù)能夠達(dá)到更高的準(zhǔn)確性和靈敏度。TIRE用于T－2毒素的檢測(cè)，能夠達(dá)到比SPR更低的檢測(cè)限［18］。利用漸逝場(chǎng)理論，采用光波導(dǎo)管光譜，可以根據(jù)層厚度的變化來測(cè)定折射率的變化，能夠測(cè)定糧食樣品中的OTA和AFB1［19］。

基于熒光偏振技術(shù)的分析方法，其原理是利用測(cè)定溶液中熒光分子自轉(zhuǎn)速率反映出不同的熒光偏振率從而對(duì)不同毒素進(jìn)行檢測(cè)。標(biāo)記螢光團(tuán)的真菌毒素微小分子，自轉(zhuǎn)速率快，表現(xiàn)出低的熒光偏振率。但當(dāng)與相應(yīng)的抗體相結(jié)合形成高分子量的免疫復(fù)合體后，其自轉(zhuǎn)速率下降同時(shí)熒光偏振率增加。這個(gè)規(guī)律適用于小麥中的DON，玉米中的伏馬菌毒素以及多種谷物中的黃曲霉毒素［20－22］。這種簡(jiǎn)便快速的分析方法，無需對(duì)樣品的清洗步驟，隨著基質(zhì)效應(yīng)，交叉反應(yīng)和提取技術(shù)等問題的解決，將成為真菌毒素的篩查方法。

Carlson等［23］研發(fā)出一種輕便、微型的免疫親和熒光生物傳感器，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)、高靈敏、快速地定量AF，可測(cè)定的濃度范圍為0.1～50μg/kg，一個(gè)樣品只需2min就可完成測(cè)定。Carter等［24］人利用光纖免疫傳感器測(cè)定花生和玉米抽提物中的AFB1，檢測(cè)限可達(dá)0.05ng/mL。

3 免疫傳感器在應(yīng)用中存在的問題

生物免疫傳感用于多種真菌毒素的檢測(cè)都取得了良好的效果，而且還在食品添加劑、致病菌、農(nóng)藥殘留和抗生素等檢測(cè)中得到了應(yīng)用［25］，但目前大部分還處于實(shí)驗(yàn)室開發(fā)應(yīng)用階段，主要存在以下幾個(gè)方面的問題。

3.1 特異性問題

雖然抗原和抗體特異性很強(qiáng)，但是不能完全消除交叉反應(yīng)和干擾。例如真菌毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有相同側(cè)鏈或者基團(tuán)的毒素在檢測(cè)過程中交叉反應(yīng)比較普遍。單端孢霉烯族毒素中的DON毒素和T－2毒素就存在交叉反應(yīng)。

3.2 穩(wěn)定性問題

在一些例如機(jī)械振動(dòng)，不穩(wěn)定電流等惡劣條件下，免疫傳感器的穩(wěn)定性會(huì)受到影響，甚至造成免疫識(shí)別元件的失效。壓電免疫傳感器的晶體雖然可以重復(fù)利用，但是經(jīng)過幾次使用后，其穩(wěn)定性明顯下降。樣本的溫度，液體樣本的粘度，離子濃度和pH等對(duì)傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性也存在一定的影響。

3.3 生物信號(hào)識(shí)別性問題

免疫傳感器的識(shí)別元件通常只能夠識(shí)別一到兩種毒素分子，而實(shí)際生產(chǎn)中通常需要對(duì)一種食品基質(zhì)中的多種真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)分析，因此對(duì)免疫傳感器的多種毒素同時(shí)識(shí)別檢測(cè)的研究還存在不足。

3.4 便攜、集成和現(xiàn)場(chǎng)適用性問題

生物免疫傳感器由檢測(cè)器、信號(hào)裝換元件、電子測(cè)量裝置以及電路等部分組成，有些還與計(jì)算機(jī)相連。多種裝置的復(fù)雜性造成了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制。現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和便攜的優(yōu)勢(shì)就沒有充分發(fā)揮。

4 展望

盡管存在一些問題，生物免疫傳感器還沒有在工業(yè)中得以廣泛應(yīng)用，但它們應(yīng)用于真菌毒素的分析檢測(cè)中極具意義。

目前針對(duì)一些問題，已經(jīng)研究出了新型材料用于免疫傳感器的生物識(shí)別元件上:例如納米材料，包括納米金、納米碳管和其他納米復(fù)合物等，它們體積小，比表面積大，表現(xiàn)獨(dú)特的光學(xué)，電學(xué)和異相催化特性;抗體酶、合成縮氨酸和蛋白質(zhì)核酸在分子印記聚合物基礎(chǔ)上的物理化學(xué)識(shí)別要素可以大量檢測(cè)低分子量聚合物。分子印記聚合物更加穩(wěn)定，活性的檢測(cè)點(diǎn)也可以再生多次，造價(jià)便宜。此外，縮微芯片能夠包含分析所具備的一切重要部分:樣品處理、反應(yīng)試劑、檢測(cè)器等。一些縮微芯片實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)已經(jīng)市場(chǎng)化了，如基因芯片。芯片技術(shù)將越來越多地進(jìn)入傳感器領(lǐng)域，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)的集成化、一體化，以達(dá)到對(duì)食品的即時(shí)檢測(cè)。

如果能夠進(jìn)一步解決生物物質(zhì)的有效性和重復(fù)性等一些技術(shù)上的問題，與傳統(tǒng)的分析方法共存，作為獨(dú)立的方法;或者作為其他技術(shù)補(bǔ)充，能夠以更低廉的費(fèi)用分析更多的樣品，對(duì)相應(yīng)的真菌毒素進(jìn)行更快速的定性定量檢測(cè)，甚至可以插入生物組織或細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)超微量在線快速跟蹤分析。可以預(yù)見，隨著性能的日趨成熟和品種的不斷增加，生物傳感器在真菌毒素的分析中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Application of immunosensors in detection of mycotoxins in food

HAN Peng－fei1，LI Hong－jun1，2，*，ZOU Zhong－yi1
(1.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China;
2.Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Chongqing 400715，China)

The mycotoxin pollution is one of the main factors that induce safety problems.Traditional analytical techniques for detection of mycotoxin were time－consuming and always accompanied with tedious sample pre－treatment and so on.This paper introduced the use of bio－immunosensors for detection of mycotoxin，focusing on the applications of the approach to detect mycotoxins in various foods.Then the technical shortcomings were put forward，and discuss the prospect of its application.

mycotoxin;bio－immunosensors;rapid detection;application;problems

TS201.1

A

1002－0306(2011)04－0430－04

2010－09－13 *通訊聯(lián)系人

韓鵬飛(1988－)，男，碩士研究生，研究方向:現(xiàn)代食品加工理論與技術(shù)。

國家973計(jì)劃項(xiàng)目(2009CB118806)。