核酸檢測技術(shù)在血液篩查中的應(yīng)用評估及建議

◆ 顏秀娟 邱昌文 石慶秋 謝家日 羅必泰

責(zé)任編輯:吳小紅

輸血相關(guān)傳染病的預(yù)防和控制已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。核酸檢測(Nucleic Acid Test，NAT)是一種新興的血液傳染病檢測方法，能顯著縮短血液感染病毒的“窗口期”，降低經(jīng)輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。但目前關(guān)于是否在我國開展NAT血液篩查的爭議較大。南寧中心血站血液檢測實(shí)驗(yàn)室作為廣西NAT血液篩查試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，于2010年11月進(jìn)入試運(yùn)行階段。文章結(jié)合工作實(shí)踐，對開展NAT血液篩查的必要性與可行性進(jìn)行了總結(jié)，并提出了相關(guān)建議。

1 必要性

1.1 現(xiàn)行血清學(xué)檢測模式不能保證血液安全

輸血傳播疾病以病毒傳播為主，在我國最引人關(guān)注的為 HBV、HCV和HIV。根據(jù)我國現(xiàn)行法律法規(guī)要求，采供血機(jī)構(gòu)對獻(xiàn)血者的病毒血清學(xué)檢測模式為:用2種不同廠家的EIA檢測試劑篩查HBsAg、抗－HCV、抗－HIV［1］。雖 然 這 種篩查模式極大地降低了輸血傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，但由于EIA檢測的是抗原和抗體，存在“窗口期”、病毒變異以及低水平攜帶者等漏檢［2］。“窗口期”是指從感染病原體到血液中可檢測標(biāo)志物的時(shí)期。病原體標(biāo)志物為抗體或抗原。HBV、HCV和HIV的“窗口期”分別為50～60d、70d 和 40d［2］。有文獻(xiàn)表明，美國90%以上輸血傳播HIV和HBV以及75%以上輸血傳播HCV的危險(xiǎn)性均來自“窗口期”感染獻(xiàn)血［3］。血清學(xué)檢測HBsAg、抗－HCV和抗－HIV陰性不能排除HBV、HCV和HIV感染。研究報(bào)道表明，EIA檢測合格的獻(xiàn)血者中，HCV RNA陽性比率為 0.01% ～0.19%，HBV DNA 陽性比率為0.4%～0.92%;在 HBV暴露率 70% ～90%的地區(qū)，獻(xiàn)血者中有7% ～19%為HBsAg陰性HBV感染者，而HB-sAg陰性HBV DNA陽性血18%可導(dǎo)致輸血后乙肝感染［4］。我國是乙肝高流行區(qū)，HBsAg攜帶者率為9.09%，HBV 流行率高達(dá) 60%［5］，抗－HCV 陽性率達(dá) 3.2%［6］，艾滋病亦處于快速傳播階段。因此，如果按照現(xiàn)行血清學(xué)檢測模式，傳染性病毒經(jīng)輸血傳播的形勢非常嚴(yán)峻。

1.2 檢測試劑敏感性不夠易造成漏檢

近年來，患者因輸血感染乙肝、丙肝或艾滋病而向法院起訴要求血站和醫(yī)療機(jī)構(gòu)予以賠償?shù)陌讣粩嘣龆唷＞科湓颍瑱z測試劑敏感性不夠而造成漏檢是重要原因之一。造成EIA檢測假陰性的原因有“窗口期”感染、免疫靜默感染、病毒變異等。不同病毒感染的“窗口期”長短不同且存在個(gè)體差異，并與檢測方法及所用試劑的敏感性有關(guān)。避免漏檢的方法是增加檢測標(biāo)志物和檢測項(xiàng)，包括抗原檢測和核酸檢測2個(gè)方面。在病毒感染早期，病毒抗原蛋白的出現(xiàn)要早于抗體，可縮短“窗口期”。可增加的抗原檢測項(xiàng)有:(1)HCV核心抗原檢測。增加此項(xiàng)檢測可縮短HCV感染檢測“窗口期”約 40～50d。但 HCV核心抗原檢測試劑昂貴，多為進(jìn)口，國產(chǎn)試劑靈敏度和特異性有待提高。(2)HIV－P24抗原檢測。P24抗原檢測法較抗體檢測可使窗口期縮短1～2周。但單獨(dú)的P24抗原檢測只能用于早期輔助診斷和病情監(jiān)測［7］。第四代 HIV EIA為 HIVP24抗原和抗體聯(lián)合檢測試劑，但由于同時(shí)把抗原和抗體包被在反應(yīng)板上，存在相互干擾的可能，檢測的特異性和敏感性都會受到影響［8］。另外，研究表明，HBV隱匿型感染是一種HBV抗原抗體陰性，HBV DNA低水平復(fù)制的慢性無癥狀乙肝病毒感染廣泛存在于普通人群中，是HBsAg篩查漏檢的主要原因。因此，在 HBV感染高度流行、抗－HBc不可行地區(qū)，HBV NAT篩查是非常必要的［9］。

2 可行性

2.1 NAT自身敏感性極高

NAT是一系列直接檢測病原體核酸技術(shù)的總稱，主要原理是使用物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，通過靶核酸直接擴(kuò)增或其附帶信號擴(kuò)增的方法，讓看不見的極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號，從而判斷標(biāo)本中是否存在相應(yīng)的病原體。其敏感性極高，可大大縮短檢測“窗口期”［10－11］。美國 2000年血清學(xué)檢測HIV和HCV的輸血感染機(jī)率分別低于1:25萬和1:130萬。NAT技術(shù)的應(yīng)用，使得HIV和HCV因“窗口期”感染的機(jī)率降低到 1:200～400 萬［1］，極大地降低了經(jīng)輸血傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。另有研究發(fā)現(xiàn)，NAT檢測可將HBV、HCV和 HIV EIA檢測的“窗口期”分別縮短為約25d(縮短45%)、59d(縮短 89%)和 11d(縮短50%)，還可檢測出因病毒變異、免疫靜默感染、人工操作錯(cuò)誤等漏檢的污染血液［11］，可有效預(yù)防經(jīng)輸血傳播疾病。

2.2 現(xiàn)實(shí)需要

近年來，我國乙肝、丙肝及艾滋病感染人群呈明顯上升趨勢。獻(xiàn)血者中感染或攜帶上述病原體的比例較高，臨床用血安全面臨巨大挑戰(zhàn)。引進(jìn)NAT血液篩查技術(shù)，可進(jìn)一步提高血液安全性，減少輸血感染事故的發(fā)生，從而增強(qiáng)公眾對醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)乃至對政府的信心，進(jìn)而保障社會穩(wěn)定。到 2010年 6月，北京、上海、杭州、大連、深圳等地血液中心和中心血站已開展NAT血液篩查檢測;2008年的北京奧運(yùn)會、2010年的上海世博會及廣州亞運(yùn)會均引進(jìn)NAT血液篩查技術(shù)，以提高用血安全性。NAT血液篩查技術(shù)的優(yōu)越性已引起國家衛(wèi)生行政部門的高度重視。2010年全國醫(yī)政工作會議指出，艾滋病、肝炎等傳染病主要是通過血液傳播，NAT血液篩查技術(shù)相對傳統(tǒng)酶免技術(shù)而言，具有速度更快、靈敏度更高等優(yōu)勢。會議將北京、上海、廣州等地15所采供血機(jī)構(gòu)確立為我國內(nèi)地首批核酸檢測試點(diǎn)單位。NAT血液篩查技術(shù)在我國的推廣與應(yīng)用將成必然趨勢。

3 建議

3.1 開展成本效益與血液殘余風(fēng)險(xiǎn)度分析

由于NAT試劑價(jià)格比常規(guī)血清學(xué)檢測試劑要貴得多，因此在探討我國是否需進(jìn)行NAT血液篩查時(shí)，必須對血液殘余風(fēng)險(xiǎn)度進(jìn)行評估。輸血后病毒感染的殘余風(fēng)險(xiǎn)度評估是一種借助數(shù)學(xué)模型的前瞻性研究。研究表明，實(shí)施核酸檢測篩查血液的發(fā)達(dá)國家，輸血后傳播病毒的殘余風(fēng)險(xiǎn)度要低于沒有實(shí)施核酸檢測的發(fā)展中國家［12］。但對于我國來說，這3種病毒的流行病學(xué)特征與國外不盡相同，照搬國外檢測模式，存在成本與效益的問題。國內(nèi)部分血站在血液篩查中對EIA檢測陰性的血樣進(jìn)行3種病毒三聯(lián)核酸檢測，都檢出了一定比率的HBV抗原陰性DNA陽性的血樣，少有HCV和HIV檢出的報(bào)道，因此在我國采用此種方法進(jìn)行篩查的成本與效益需進(jìn)行更深一步地評估。

3.2 檢測模式及試劑選擇

NAT試劑本身的質(zhì)量及采用何種檢測模式，直接關(guān)系到該項(xiàng)技術(shù)的實(shí)際作用［13］。最初應(yīng)用 NAT篩查血液時(shí)，一般采取混樣檢測模式以降低成本，但匯集樣本數(shù)越多，漏檢的可能性就越大。因此，國際流行趨勢是盡可能小樣本混樣或單個(gè)檢測。是否匯集或匯集樣本數(shù)為多少取決于所用試劑的靈敏度，還與當(dāng)?shù)孬I(xiàn)血人群中病毒感染者的陽性率以及病毒載量攜帶者的比例有關(guān)。目前，國外多采取小樣本混樣或單人份NAT檢測;國內(nèi)試行核酸血液篩查的血站引用技術(shù)各有不同，混樣規(guī)模從50人份到 5 人份不等［10］。

臨床診斷和血液篩檢是兩個(gè)不同的應(yīng)用領(lǐng)域，血液篩檢試劑的要求比臨床診斷更高。所以，開展NAT血液篩查時(shí)應(yīng)注重試劑本身的質(zhì)量。應(yīng)選擇靈敏度高、重復(fù)性好、特異性好的試劑，尤其是對HBV NAT試劑的靈敏度要求應(yīng)比HCV及HIV NAT高，以防止低拷貝的病毒陽性的血液漏檢。目前，國內(nèi)開展NAT血液篩查多采用進(jìn)口試劑，國產(chǎn)NAT試劑尚未廣泛應(yīng)用，主要是因?yàn)樵噭╈`敏度和特異性較低。迄今為止，正式通過美國FDA認(rèn)證的試劑僅有2種，即Roche S201 MPX 6人份混合檢測及Chiron ProcleixTMA技術(shù)。但進(jìn)口試劑的高額成本也限制了其應(yīng)用。因此，研發(fā)出適合我國國情的高靈敏度、低成本的NAT血液篩查試劑是國內(nèi)采供血機(jī)構(gòu)開展NAT血液篩查的前提。

3.3 實(shí)行標(biāo)本集中化檢測

NAT檢測不但試劑昂貴，而且對基礎(chǔ)設(shè)施、檢測環(huán)境、人員培訓(xùn)和管理模式等都有較高要求，成本很高。目前，有些國家實(shí)行標(biāo)本集中化檢測，優(yōu)勢很明顯。但在我國要實(shí)施標(biāo)本集中化檢測，還存在許多問題有待試點(diǎn)和妥善解決。集中化檢測模式可以充分利用資源，提高檢測質(zhì)量和檢測效率、降低檢測成本，可逐步試行。具體做法可采取打破行政區(qū)劃及隸屬關(guān)系，實(shí)行地域管理。現(xiàn)代化的交通及通訊為實(shí)現(xiàn)這種模式提供了基礎(chǔ)，發(fā)達(dá)地區(qū)可優(yōu)先考慮采取這種模式。以南寧中心血站為例，血站作為廣西首府城市血站，即將開展的標(biāo)本集中化檢測得到了政府的大力支持。實(shí)驗(yàn)室建設(shè)、自動(dòng)化檢測設(shè)備購置、人才引進(jìn)及人員培訓(xùn)等均得到了很好地落實(shí)，為開展NAT檢測提供了有利條件。

3.4 有符合技術(shù)要求的實(shí)驗(yàn)室

核酸血液篩查技術(shù)是精密的檢驗(yàn)技術(shù)，易受環(huán)境影響。因此，需建設(shè)一個(gè)符合技術(shù)要求的實(shí)驗(yàn)室，以保障檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室建設(shè)時(shí)應(yīng)注意:血清學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與NAT實(shí)驗(yàn)室分開，各自獨(dú)立為2個(gè)實(shí)驗(yàn)室;NAT實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)應(yīng)符合《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》相關(guān)規(guī)定，并符合基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室區(qū)域設(shè)置原則。NAT各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，以防止人員、儀器設(shè)備、血樣、試劑等交叉污染。

3.5 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的建立

對NAT檢測的質(zhì)量管理直接關(guān)系到該項(xiàng)技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用效果。如果沒有全面的質(zhì)量管理，NAT篩查血液不僅可能會漏檢，還可能會出現(xiàn)大量假陽性問題。當(dāng)大量假陽性結(jié)果出現(xiàn)后，不僅拆分復(fù)查工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，還會影響正常發(fā)血。血液標(biāo)本的質(zhì)控是整個(gè)檢測過程的最關(guān)鍵的控制點(diǎn)之一，對血液檢測質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響。因此，為確保血液標(biāo)本的質(zhì)量，需建立完善的標(biāo)本留樣和處理程序，以保證采集標(biāo)本的完整性，即正確采集、貯存、運(yùn)輸并正確離心分樣等［14］。同時(shí)，通過建立標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范NAT檢測人員的操作，嚴(yán)格執(zhí)行防污染措施，可避免樣品間的交叉污染和擴(kuò)增物的污染。

總之，新方法、新技術(shù)的應(yīng)用要考慮檢測成本、試劑與儀器設(shè)備的配套、人員技術(shù)的培訓(xùn)以及對現(xiàn)行法律修訂的跟進(jìn)等。但隨著NAT篩查試劑質(zhì)量的提高和成本的下降，以及我國血液篩查模式的轉(zhuǎn)變、管理水平的提高和經(jīng)費(fèi)的落實(shí)，我們堅(jiān)信，血液NAT篩查在我國將有著廣闊的前景。

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