長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失遺傳特性分析及腦缺血模型高發(fā)群體的初步培育

周好樂，杜小燕，路 靜，王 迎，陳振文

（1.首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，北京 10086；2.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)教研室，呼和浩特 010059）

長(zhǎng)爪沙鼠是源自我國(guó)的“多功能”實(shí)驗(yàn)動(dòng)物［1］。由于其腦底動(dòng)脈環(huán)前后交通支存在不同程度的缺失，不能構(gòu)成完整的Willis動(dòng)脈環(huán)而成為天然的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停炎鳛檠芯磕X缺血或腦梗塞后大腦各種基因激活與表達(dá)變化、各種神經(jīng)遞質(zhì)的代謝變化、大腦組織的病理學(xué)變化以及腦缺血或腦梗塞治療的理想模型得到廣泛應(yīng)用［2-4］。但遺憾的是，大量研究結(jié)果顯示，有這一特點(diǎn)的長(zhǎng)爪沙鼠僅有（30～40）％，換言之，只有35％的長(zhǎng)爪沙鼠單側(cè)結(jié)扎頸總動(dòng)脈后出現(xiàn)典型腦缺血癥狀，成為可用的腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ停?，6］。其余動(dòng)物中約有一半在短時(shí)間內(nèi)死亡，另一半根本無腦缺血癥狀產(chǎn)生。科學(xué)家們一直在尋找可以預(yù)測(cè)長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血發(fā)生情況的方法［7-9］，但到目前為止，尚不能解決由于Willis環(huán)變異種類多而造成單側(cè)結(jié)扎頸總動(dòng)脈腦缺血模型不穩(wěn)定和不均一的問題。因此，通過動(dòng)物的定向培育來降低前后交通動(dòng)脈的變異，即培育前后交通支缺失的長(zhǎng)爪沙鼠群體是解決問題的根本途徑。本研究擬通過對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠親代與子代腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失類型的觀察，研究其前、后交通支變異情況的遺傳特性。并以此為依據(jù)，定向培育長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血模型高發(fā)生率群體。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

長(zhǎng)爪沙鼠（首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供），398只，合格證號(hào)SCXK（京）2000-0012，清潔級(jí)。動(dòng)物自由飲水和采食，飼料購(gòu)于維通利華飼料有限公司。室溫為（22±2）℃，相對(duì)濕度50％～70％，人工光照明暗各12h。

1.2 長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失遺傳特性分析

從剛離乳的仔沙鼠中隨機(jī)選取10對(duì)，雌雄配對(duì)后采取長(zhǎng)期同居法單籠飼養(yǎng)，待沙鼠性成熟后自然交配繁殖。當(dāng)產(chǎn)下的第1窩子代成熟后，按照文獻(xiàn)方法［5］對(duì)所有子代動(dòng)物行右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，觀察術(shù)后癥狀及腦缺血模型的發(fā)生率，然后心臟灌注血管鑄型，解剖觀察子代的Willis環(huán)變異缺失類型。讓親代繼續(xù)繁殖第2和第3窩（第2窩產(chǎn)子數(shù)少或雌雄比例不當(dāng)時(shí)生產(chǎn)第3窩），待第2和第3窩仔鼠成熟后，讓同父母雌雄個(gè)體配對(duì)繁殖下一代。同時(shí)將親代雌雄個(gè)體動(dòng)物行右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，觀察術(shù)后癥狀及腦缺血模型的發(fā)生率，然后心臟灌注血管鑄型，解剖觀察子代的腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失類型，并與其子代的術(shù)后癥狀、腦缺血模型的發(fā)生率和Willis環(huán)變異缺失類型進(jìn)行比較。按此方法繁殖并比較觀察5代動(dòng)物。記錄所有長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)類型觀察結(jié)果，然后通過對(duì)父母與子代的腦底動(dòng)脈Willis環(huán)血管類型分析找出親代與子代的Willis環(huán)變異缺失的遺傳特點(diǎn)。

1.3 長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血模型高發(fā)生率培育

選取上述實(shí)驗(yàn)中長(zhǎng)爪沙鼠行單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后腦缺血模型發(fā)生率高（＞50％）、模型癥狀典型、親代和子代腦底動(dòng)脈Willis環(huán)后交通支缺失伴前交通支細(xì)小或缺失的兄妹動(dòng)物進(jìn)行繁殖。在保證動(dòng)物連續(xù)繁殖不斷代的前提下，將親代和子代動(dòng)物行右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，觀察術(shù)后癥狀及腦缺血模型的發(fā)生率，然后心臟灌注血管鑄型，解剖觀察腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失類型，并將親代與其子代的術(shù)后癥狀、腦缺血模型的發(fā)生率和Willis環(huán)變異缺失類型進(jìn)行比較，從而驗(yàn)證所推測(cè)的遺傳規(guī)律，定向培育長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血高發(fā)生率種群。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS11.5軟件用皮爾遜檢驗(yàn)（Pearson Chi-Square）對(duì)不同Willis環(huán)變異類型與父母遺傳關(guān)系之間的差異，判斷不同 Willis環(huán)變異類型與父母的遺傳關(guān)系有無差異。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失的遺傳特性分析

通過對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠F1至F5代51對(duì)種鼠及其子代共計(jì)398只動(dòng)物的腦底動(dòng)脈Willis環(huán)解剖比較觀察，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)的變異缺失類型具有明顯的遺傳性。當(dāng)雙親的Willis環(huán)前交通支都完整時(shí)，其子代均具有完整的前交通支；而當(dāng)親代存在前交通支變異時(shí)，其子代可出現(xiàn)多種類型的前交通支變異情況。同樣子代后交通支的變異情況也與其親代有遺傳相關(guān)性。其中前交通支與母親一致率為60.4％，前交與父親的一致率為48.2％，兩者的差異有顯著性意義P=0.015；后交與父母的差異沒有顯著性意義P=0.055。不同Willis環(huán)變異的遺傳情況見表1。

表1 父母與子代的Willis環(huán)前交通支相關(guān)性Tab.1 The relationship of ACoAs in the parents and children

表2 F1代到F5代長(zhǎng)爪沙鼠的CoW類型和癥狀的分析Tab.2 Analysis of COW patterns and symptoms from generations F1to F5

2.2 長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血模型高發(fā)生率和低發(fā)生率群體的培育

隨著定向培育長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血高發(fā)生率種群代數(shù)的增加，行單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎時(shí)，高發(fā)種群腦缺血模型成功率隨著培育代數(shù)的增加而逐漸提高，已由F1代的40％上升到F5代的75％（圖1）。

圖1 經(jīng)單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后腦缺血模型動(dòng)物中神經(jīng)評(píng)分大于等于2的動(dòng)物數(shù)隨培育代數(shù)的增加而提高Fig.1 The percentages of UCO cerebral ischemic animals with neurological score of 2 and above were increaseing with the number of breeding generations

隨著定向培育代數(shù)的增加前后交通支的變異缺失也逐漸趨同，從F1～F5代腦缺血模型高發(fā)群體腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失類型變化的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：Willis環(huán)前交通支細(xì)小或缺失率由F1的35％上升到F5的63.6％；Willis環(huán)后交通支細(xì)小或缺失率由F1的45％上升到F5的77.3％。模型癥狀的發(fā)生率和顯著成度也逐步提高（表2）。

3 討論

3.1 腦底動(dòng)脈Willis環(huán)變異缺失的遺傳性

由于目前還不清楚Willis環(huán)變異缺失的機(jī)制，科學(xué)家認(rèn)為該變異與遺傳有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行了Willis環(huán)遺傳特性分析，結(jié)果顯示：當(dāng)雙親的Willis環(huán)前交通支都完整時(shí)，其子代大部分具有完整的前交通支；而當(dāng)親代存在前交通支變異時(shí)，其子代可出現(xiàn)多種類型的前交通支變異情況；子代的個(gè)體間表型并沒有明顯的性別間差異；同樣子代后交通支的變異情況也與其親代有遺傳相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：前交與母親一致率為60.4％，前交與父親的一致率為48.2％，兩者的差異有顯著性意義P=0.015。由此進(jìn)一步證明了長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈Willis環(huán)的變異缺失具有明顯的遺傳性，且前交通動(dòng)脈與母親的關(guān)系更密切。

3.2 腦缺血高發(fā)模型種群定向培育

長(zhǎng)爪沙鼠腦底動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)的變異導(dǎo)致長(zhǎng)爪沙鼠半腦缺血模型不穩(wěn)定和不均一，雖然有多個(gè)學(xué)者試圖通過眼底血流等方法預(yù)測(cè)腦缺血的發(fā)生［7-9］，但并沒有徹底解決這個(gè)問題。因此，本實(shí)驗(yàn)從定向培育高發(fā)群體入手，使長(zhǎng)爪沙鼠群體的解剖結(jié)構(gòu)趨于一致，從根本上解決長(zhǎng)爪沙鼠腦缺血模型發(fā)生率低的問題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該方法具有一定的可行性，通過同父母的第一窩動(dòng)物預(yù)測(cè)第二窩的缺失率，并進(jìn)行定向培育半腦缺血高發(fā)生率群體，使動(dòng)物右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎后腦缺血模型的成功率由F1代的40％上升到F5代的75％。通過對(duì)F1～F5代腦缺血模型高發(fā)群體的血管類型變化及癥狀變化的統(tǒng)計(jì)顯示：前交通支細(xì)小或缺失的百分率由F1代的35％上升到F5代的63.6％；后交通支細(xì)小或缺失的百分率由F1代的45％上升到F5代的77.3％；造模成功率由F1代的40％上升到F5代的75％。由于在群體培育中部分采用了近交方式，因此繁殖到F4代以后遇到了近親交配引起的繁殖障礙，主要表現(xiàn)為：種鼠生育周期延長(zhǎng)、生育能力下降、哺育能力下降和仔鼠畸形等情況，導(dǎo)致種群的培育過程放緩。為了克服近親阻滯帶來的不良影響，在保證腦底動(dòng)脈Willis環(huán)的變異缺失類型相同的前提下采取回交的培育方式，本實(shí)驗(yàn)中采用回交方法配7對(duì)，均成功繁育出下一代。由于沙鼠的生活習(xí)性等問題，尚未見沙鼠成功回交的文獻(xiàn)報(bào)道。目前為止，只有Fujisawa等［10］對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠定向培養(yǎng)了癲癇敏感和低發(fā)近交系的報(bào)道。盡管在首都醫(yī)科大學(xué)腦缺血高發(fā)群體中到F5代時(shí)腦缺血模型成功率達(dá)到75％，但如何保持這一高發(fā)生率仍然是個(gè)問題，因此，下一步我們將（事實(shí)上我們已經(jīng)開始）培育腦缺血高發(fā)的近交系長(zhǎng)爪沙鼠，來進(jìn)一步提高Willis環(huán)類型的一致性和單側(cè)結(jié)扎頸總腦缺血模型的穩(wěn)定性。

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