雪貂感染流感病毒H3N2動物模型的建立

鮑琳琳，占玲俊，鄧 巍，許黎黎，朱 華，呂 琦，李楓棣，秦 川

（中國醫學科學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

流感病毒具高傳染性，且每年在很多國家都會造成區域性的流行。20世紀曾發生過4～5次世界大流行（pandemics），每次間隔9～39年；其中以1918～1919年期間，H1N1流感病毒造成4 500萬人的死亡最為嚴重［1］。自1933年以來甲型病毒已經歷了4次抗原轉變：1933～1946年為H0N1（原甲型，A0），1946～1957年為H1N1（亞甲型，A1），1957～1968年為H2N2（亞洲甲型，A2），1968年以后為H3N2（香港型，A3）。2009年8月，根據香港最近的流感病毒分析，甲型H1N1流感占49％，H3占43％，顯示兩種病毒已成主流。甲型H3病毒在香港相當普遍，2008年主要是Brisbane型，2009年出現的甲型H3流感病毒與Brisbane型不同，出現基因漂移情況，但應是源自Brisbane型的變種。2009年8月，據報道，香港已出現3宗因H3流感的死亡個案。所以，在系統研究流感，預防和治療流感任重而道遠。

研究流感過程中重要環節就是動物試驗，因此流感病毒感染動物模型的合理建立顯得尤為重要。雪貂是目前為止最為敏感的流感病毒感染動物模型，本研究應用雪貂建立H3流感動物模型，從臨床癥狀到實驗室檢測多個方面系統的評價雪貂感染后的變化，為研究H3流感病毒發病機制評價藥物和疫苗奠定基礎［2，5］。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 毒株：H3N2病毒株為A/Brisbane/10/07，其HA效價都為1：256，107TCID50/mL，由香港大學陳鴻霖教授惠贈。

1.1.2 動物：由美國引進去勢雪貂（Mustela Pulourius Furo）6只，4～10月齡，500～1 200g。實驗前進行血清學檢查，HI方法檢測H1N1，H3N2抗體，抗體陰性為合格雪貂方可入組實驗。

1.1.3 試劑：RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購自Qiagen公司，逆轉錄試劑盒SuperScriptⅢ First-Strand Synthesis System購自Invitrogen公司，熒光染料Power SYBR green PCR master mix，48孔0.2ml PCR反應管fast optical 48-well RXN plate，及光學反應蓋膜48-well optical adhesive film 25PK均購自ABI公司，實時熒光定量PCR儀為ABI公司StepOne系列產品。

1.2 方法

1.2.1 雪貂的感染性：實驗在本所的BSL-2實驗室中進行。將6只雪貂隨機分為2個組，每個滴度3只，每籠1只。將雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉，將流感A/Brisbane/10/07病毒株分別以106TCID50和107TCID50滴鼻感染，每只雪貂鼻孔內均勻滴入500μL病毒液。獨立送風隔離籠具中正常飼養。實驗的觀察期為5d。

1.2.2 皮下芯片植入：實驗開始前2周，雪貂采用獸用氯胺酮輕度麻醉后，皮下植入芯片，通過芯片錄入實驗動物編號，每日讀取動物體溫數值。

1.2.3 臨床觀察和取樣：實驗開始前1周每日記錄雪貂體溫及體重變化作為感染前背景資料。感染后每天記錄體溫、體重變化、觀察并記錄有無咳嗽、流涕、嘔吐、腹瀉、氣促、呼吸困難、明顯食欲缺乏等臨床表現。感染前0天，感染后第1～5天取鼻甲骨活檢物測定病毒載量和病毒滴度。感染后第5天安樂處死動物，取動物肺、肝、脾、肺、小腸、腦組織測定病毒滴度，做病理檢查。

1.2.4 病毒滴度的測定：雪貂取肺、肝、脾、小腸、腦組織放入1mL DMEM（青霉素、鏈霉素各1 000IU/mL）液中，用勻漿器將組織研磨成乳劑，3 000r/min離心10min，取上清液。組織上清液10×連續稀釋至10-8，接種于單層培養MDCK細胞的96孔細胞培養板上，每個稀釋度接種4個重復孔，CO2培養箱中35℃靜止培養，觀察記錄各孔細胞病變（CPE）情況，連續觀察3d，用1％火雞血球復檢，出現凝集反應的結果為陽性［3］。按照Reed-Muench方法計算感染雪貂臟器病毒的TCID50。

1.2.5 病理學檢查：大體觀察，處死動物后，詳細觀察肺、腸組織的形態變化；病理切片制備，取處死動物的肺、腸組織，10％甲醛液固定，石蠟包埋，常規病理組織切片處理后，HE方法染色，鏡檢觀察。

1.2.6 PCR檢測：鼻甲骨活檢物可以直接應用試劑盒RNeasymini kit（Qiagen）提取RNA。鼻甲骨活檢物溶于1mL DMEM培養基中，RNA最終濃度溶入無RNA酶的水中，20mg肺組織總RNA提取物定容于30 μL無RNA酶的水中。總RNA中取8μL RNA應用SuperScriptⅢ reverse transcriptase（Invitrogen）逆轉錄。取cDNA2μL應用Power SYBR green PCR master mix（ABI）作定量PCR。引物：BR-10F 5’-gagaatccagcacacaagag-3’，BR-10R 5’-ttctcagttcaagagtgctc-3’。程序：①94℃，3min；②94℃，30s，③61℃，30s，④72℃，30s（②-④運行35個循環），⑤95℃，15s；⑥60℃，1min；此后運行溶解曲線程序，95℃，15s，60℃，1min；95℃，15s。熒光定量PCR儀可直接讀取病毒載量結果。

表1 雪貂感染H3N2后體重變化Tab.1 Changes of the body weight of ferrets infected with H3N2 influenza virus

2 結果

2.1 雪貂感染后體重變化

雪貂感染后出現體重下降，106TCID50組由感染后第1天一直持續到實驗結束，107TCID50組在感染后第1天呈現體重下降，在感染后第4天到實驗結束體重開始回升，體重變化見表1。雪貂感染后體重變化率見圖1。

圖1 雪貂感染H3N2后體重變化率（％）Fig.1 Changes of the body weight of ferrets infected with H3N2 influenza virus（％）

2.2 雪貂感染H3N2后體溫變化

雪貂感染H3N2后出現體溫升高，106TCID50組在感染后第2天、第3天出現體溫升高，107TCID50組在感染后第2天出現體溫一過性升高，體溫變化見圖2。

2.3 雪貂感染后臨床表現

圖2 雪貂感染H3N2后體溫變化℃Fig.2 Changes of the temperature of ferrets infected with H3N2 influenza virus

表2 雪貂感染H3N2后臨床評分標準：Tab.2 Criteria for clinical sign scores in the ferrets after H3N2 influenza virus infection

圖3 雪貂感染后臨床表現評分（分）Fig.3 Scores of clinical signs of the ferrets infected with H3N2 influenza virus

雪貂感染H3N2后的表現臨床評分標準：NIH提供的雪貂感染實驗觀察指標分為鼻部癥狀和活動度兩個部分，具體指標見表2。2組感染的雪貂臨床變化相似，雪貂在感染后1d出現癥狀，主要表現為流涕、打噴嚏等上呼吸道感染的表現，伴有一定程度的活動度下降。雪貂感染后臨床變化情況見圖3。

2.4 感染雪貂病理變化結果

感染5d后，雪貂安樂死解剖，大體觀察到肺組織背側面和腹側面有散在點狀出血灶，其他組織未見異常。鏡下觀察發現以肺組織輕度間質性肺炎為主要表現，肺組織肺靜脈及肺泡壁毛細血管明顯擴張充血，部分肺靜脈壁及周圍組織明顯水腫，局部支氣管及肺泡上皮細胞壞死、脫落，肺泡腔內可見滲出和漏出的紅細胞、水腫液、炎細胞及壞死脫落的上皮細胞碎屑。其他組織未見明顯異常（圖4，見封二）。106TCID50組與107TCID50組肺組織病變差異沒有顯著性。

2.5 感染雪貂病毒的復制及釋放

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒滴度測定，結果顯示106TCID50組雪貂在感染后第2天就可以檢測到病毒，滴度為102.1TCID50，一直到感染后第4天可以檢測到病毒，而且觀察到鼻甲骨活檢物的病毒檢測呈現下降的趨勢。107TCID50組雪貂在感染后鼻甲骨活檢物沒有檢測到病毒，結果見表3。以上的結果說明H3N2病毒感染雪貂后，出現上呼吸道排毒的現象，而且病毒的復制和釋放隨著感染的天數呈現下降的趨勢。從另外一方面來看，2個滴度的病毒感染雪貂后，上呼吸道排毒的現象結果不一致在一定程度上顯示106TCID50是一個感染雪貂比較合適的劑量。

雪貂在感染后第5天安樂處死，取雪貂肝、脾、肺、小腸、腦組織做病毒滴度測定。結果顯示肝、脾、肺、腦組織都未分到病毒，106TCID50組雪貂小腸組織的病毒在101.8～102.3TCID50之間，106TCID50組在101.8TCID50（表4）。以上的結果反映了H3N2病毒感染雪貂是主要以上呼吸道受到病毒感染為主，肺組織受到病毒感染的程度比較低。腸道組織的高病毒滴度從一定程度可以說明H3N2病毒株可以感染呼吸道以外的組織臟器，并在其中復制釋放。

雪貂感染后，每天取鼻甲骨活檢物做病毒載量測定，結果顯示2個滴度組雪貂在感染后第1天至感染后第5天，上呼吸道排毒都呈下降趨勢，見圖5。從106TCID50組和107TCID50組雪貂鼻甲骨的病毒載量測定結果來看沒有差異。

3 討論

利用小鼠模型能夠進行流感病毒感染、免疫和抗流感病毒藥物作用等方面的研究。小鼠作為流感的動物模型會表現為較重的下呼吸道感染的癥狀（間質性肺炎），有一些人際感染的流感病毒在小鼠身上并不能復制，需要經過多代的適應建立相應的鼠肺適應株才能夠感染小鼠。雪貂是目前比較公認的流感適合的動物模型，A型和B型流感病毒都可在雪貂上直接感染不需要經過傳代適應。雪貂的解剖結構分為上下氣室，有利于研究流感病毒對不同氣室的感染。

表3 雪貂感染后鼻甲骨活檢物病毒培養滴度情況（log10TCID50）Tab.3 Virus detection and titration in samples from nasal cavity（virus titer was expressed in log10TCID50）

表4 雪貂感染后組織病毒培養滴度情況（log10TCID50）Tab.4 Virus culture from tissues of ferrets（log10 TCID50）

圖5 雪貂鼻中病毒載量變化Fig.5 Virus loading from nose of infected ferrets

本次實驗中雪貂感染H3N2病毒后出現明顯的上呼吸道感染的癥狀，例如體重下降，體溫升高，活動度下降，流涕，打噴嚏等，這與人感染季節性流感病毒后的癥狀是相似的，雪貂感染后肺部病理改變是散在的點狀病灶［4，6］。本試驗應用的病毒株是A/Brisbane/10/07，病毒感染雪貂后，病毒分離結果顯示，106TCID50組雪貂鼻甲骨活檢物在第1天至第4天都可以分離到活病毒，這個結果反映了雪貂感染后出現了持續的上呼吸道排毒，并且病毒的排出呈現下降趨勢，鼻甲骨活檢物病毒載量的結果也與這一結果相吻合。107TCID50的A/Brisbane/10/07病毒株感染雪貂后，病毒分離的結果沒有顯示出上呼吸道排毒現象，病毒載量的結果與A/HK/43358/09感染的結果相似，呈現出病毒載量逐天下降的趨勢（結果未顯示）。這表明A/HK/43358/09病毒株的感染力較弱，相比較而言A/Brisbane/10/07更適于建立雪貂感染H3N2動物模型。A/Brisbane/10/07病毒株感染雪貂后，解剖大體檢查發現肺組織上、中、下肺葉背側面和腹側面有散在點狀暗紅色出血灶，鏡下可見肺毛細血管明顯擴張充血，周圍有水腫，局部支氣管及肺泡上皮細胞壞死、脫落，肺泡腔內可見大量滲出和漏出的紅細胞、水腫液、炎細胞及壞死脫落的上皮細胞碎屑［7］。總結幾方面的結果發現106TCID50組雪貂的臨床癥狀和病毒分離結果較107TCID50組更明顯，106TCID50的病毒滴度更適用于建立感染雪貂模型。

季節性流感H3N2病毒是A型流感病毒中比較溫和的病毒株，難以感染小鼠，建立小鼠感染動物模型通常需要建立鼠肺適應株［8］。對于H3N2病毒感染機制的研究，藥物、疫苗評價需要合適的動物模型，本次試驗的結果說明雪貂感染的動物模型在臨床表現、病毒復制情況以及實驗室檢查結果幾方面都與人感染流感后結果相似，為H3N2流感病毒研究提供了一個研究平臺。

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