MicroRNA-153對靶基因下游信號分子GSK-3β表達水平及細胞抗損傷能力的影響

梁春聯，朱 華，黃 瀾，許艷峰，鄧 巍，馬春梅，劉 穎，秦 川

（衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021）

MicroRNA（miRNA）是一類長約22個核苷酸的內源性小分子單鏈RNA，通過抑制轉錄后mRNA的翻譯或降解而調控蛋白表達。腦組織中富含miRNA，因此，其在神經系統發育及疾病中發揮著重要作用。經鑒定，Mir-153是人和小鼠腦組織特異性表達的7種miRNA之一［1］。文獻報道，mir-153可調控a-synuclein的表達從而在帕金森病的發病機制中起到一定的作用［2］。本課題前期研究結果表明，mir-153可在體內外調控阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）主要致病基因APP（Amyloid protein precursor，APP）及APLP2（Amyloid precursor-like protein 2，APLP2）的表達。APP和APLP2同屬于一類高度保守的跨膜糖蛋白家族，且APP和APLP2經蛋白酶水解后均可生成位于胞內的小分子肽段（intracellular domains，ICDs），大量研究表明，除Aβ肽外，ICDs在AD的發病機制中也起著重要作用，然而其具體的作用途徑尚有待進一步闡明。文獻報道，ICDs可活化糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）等基因的表達，而GSK-3β則是磷酸化TAU蛋白的主要激酶之一，因此，GSK-3β將淀粉樣蛋白沉積和TAU蛋白磷酸化這兩個AD主要的病理特征緊密聯系在一起［3］。然而，關于ICDs的轉錄活化作用尚存有爭議。此外，多方研究顯示ICDs還可降低細胞抗應激的能力、促進其凋亡水平的增加。鑒于我們前期的研究結果，mir-153可抑制APP和APLP2的蛋白表達，從而降低其胞內水解片段ICDs的水平。因此，我們推測mir-153也會影響下游信號分子GSK-3β的轉錄活性及細胞凋亡水平。為了對上述推論進行驗證，本文對高表達mir-153時GSK-3β的蛋白水平及細胞抗氧化應激和毒性刺激的能力進行了檢測，以期進一步探討mir-153在AD發病中的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

將鼠mir-153表達載體（OriGene）注入C57BL/6J小鼠受精卵細胞內，構建mir-153轉基因小鼠，轉基因由巨細胞病毒啟動子啟動表達。PCR鼠尾鑒定成功轉入外源基因的陽性小鼠，再經real-time PCR篩選高表達mir-153的陽性小鼠作為實驗動物。動物合格證號：ILAS-PL-2010-003。

1.2 mir-153穩轉細胞系的構建

SH-SY5Y細胞培養于加有10％熱滅活胎牛血清和100U/mL青鏈霉素的DMEM培養液（Gibco）中，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）將mir-153表達載體或陰性對照質粒轉入細胞內，轉染后48h將細胞按一定比例稀釋后傳到10cm皿中培養，并加入3μg/mL的blasticidin進行篩選。經3～4周的抗性篩選后挑取帶GFP的陽性單克隆進行擴大培養，real-time PCR篩選高表達mir-153的單克隆細胞系。

1.3 Western-blot

提取穩轉細胞系及轉基因小鼠腦總蛋白，將40μg蛋白經12％的SDS-PAGE膠分離后轉移至NC膜上，在含5％牛奶的TBST中室溫封閉1h，經鼠抗tau單克隆抗體（sc-166060，Santa Cruz），鼠抗gsk-3β單克隆抗體（sc-53931，Santa Cruz），兔抗p-tau多克隆抗體（ab4864，Abcam），兔抗p-gsk-3β多克隆抗體（ab-75745，Abcam）4℃過夜雜交，TBST洗膜后，與HRP標記的羊抗兔IgG進行雜交，室溫孵育1h，TBST洗膜后進行化學發光反應，同時檢測甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的表達作為內參。

1.4 Aβ42和H2O2的制備及分組

如文獻所述，用六氟異丙醇（hexafluoroisopropanol，HFIP，Sigma）溶解凍干粉狀的Aβ42肽（Sigma），將HFIP徹底揮發后制成Aβ肽膜，再用無水的二甲基亞砜（DMSO，Sigma）溶解肽膜制成5mmol/L的肽/DMSO溶液，用無酚紅的F12培養液（Gibco）將其稀釋至100μmol/L，4°C孵育24h后即得Aβ42寡聚體，試驗前用不含血清的培養液將其稀釋至使用濃度。將30％的H2O2溶液（北京化工廠）先用無菌的去離子水配成儲存液，然后再用不含血清的培養液將其稀釋至終濃度［4］。

分組：（1）對照處理組：將mir-153穩轉細胞、陰性質粒穩轉細胞分別經稀釋用的無血清培養液作用12～24h；（2）Aβ42處理組：mir-153穩轉細胞、陰性質粒穩轉細胞分別經10μmol/LAβ42作用12～24h；（3）H2O2處理組：mir-153穩轉細胞、陰性質粒穩轉細胞分別經200μmol/L H2O2作用12～24h。

1.5 細胞增殖水平的檢測

以1.5×104/孔的密度將細胞接種于96孔板中，培養過夜后，加入Aβ42或H2O2，每組設3復孔，同時設空白孔，即不含細胞的無血清培養液孔。作用12h后，使用細胞增殖檢測試劑盒（G3582，Promega）于酶標儀上測定490nm吸光度（A）值。按公式：細胞存活率=（mir-153或陰性質粒穩轉細胞處理組A值-空白孔A值）÷（mir-153或陰性質粒穩轉細胞對照處理組A值-空白孔A值），計算各組細胞存活率。

1.6 細胞凋亡水平的檢測

圖1 穩轉細胞系內p-tau及p-gsk-3β蛋白的表達Fig.1 The expression of p-tau and p-gsk-3β protein in stably transfected cells

圖2 穩轉細胞系內tau及gsk-3β總蛋白的表達Fig.2 The expression of tau and gsk-3β total protein in stably transfected cells.

如上所述，將細胞接種于96孔培養板中，經Aβ42和H2O2作用24h后，收集細胞調整濃度，取1×105個細胞分別加入5μL annexinV及5μL 7-AAD（PE annexin V apoptosis detection kit.Biosciences），室溫避光孵育15min后加入binding buffer，立即上流式細胞儀分析。

1.7 統計分析

數據經SPSS軟件處理，t檢驗進行統計學分析，結果以±s表示，以P＜0.05定義為差異有顯著性。

2 結果

2.1 Western blot檢測穩轉細胞系及轉基因小鼠體內tau及gsk-3β的表達

提取穩定轉染mir-153表達載體及陰性對照質粒的SY5Y細胞總蛋白，經12％SDS膠分離之后檢測磷酸化tau蛋白、磷酸化gsk-3β以及其總蛋白的表達。結果顯示（圖1，2），以轉染陰性對照質粒的穩轉細胞作為對照，穩定轉染mir-153表達載體的細胞中磷酸化gsk-3β及其總蛋白的表達水平均降低。同時，磷酸化tau蛋白的表達水平也顯著降低而其總蛋白的表達無明顯變化。提取mir-153轉基因小鼠腦蛋白，同樣經Western-blot檢測上述蛋白的表達。結果顯示（圖3，4，5），與穩轉細胞結果相一致，轉基因小鼠腦內gsk-3β及其總蛋白的表達水平較同窩陰性鼠均降低，而磷酸化tau蛋白及其總蛋白的表達則無明顯變化。

圖3 Mir-153轉基因鼠體內p-gsk-3β蛋白的表達Fig.3 The expression of p-gsk-3β protein in mir-153 transgenic mice

圖4 Mir-153轉基因鼠體內p-tau蛋白的表達Fig.4 The expression of p-tau protein in mir-153 transgenic mice

圖5 Mir-153轉基因鼠體內tau及gsk-3β總蛋白的表達Fig.5 The expression of tau and gsk-3β total protein in mir-153 transgenic mice

圖6 Aβ42和H2O2處理后細胞活力的檢測。*P＜0.05Fig.6 The assay of cell viability after Aβ42和H2O2treatment.*P＜0.05

2.2 Aβ42和H2O2處理后細胞增殖水平的檢測

將穩定轉染mir-153表達載體或陰性對照質粒的SY5Y細胞分別經Aβ42和H2O2處理12h后，MTS法分析細胞增殖活力水平的變化，每次各處理組重復3復孔，試驗重復3次，t檢驗進行統計學分析。結果顯示（圖6），mir-153穩轉細胞系經Aβ42和H2O2處理后，其增殖活性均較經同樣處理的陰性質粒穩轉細胞系顯著降低（P＜0.05）。

2.3 Aβ42和H2O2處理后細胞凋亡水平的檢測

將穩定轉染mir-153表達載體或陰性對照質粒的SY5Y細胞分別經Aβ42和H2O2處理24h后，流式細胞儀檢測凋亡細胞數量的變化，每次各處理組重復2個樣本，試驗重復2次，經統計分析后結果顯示（圖7），mir-153穩轉細胞系與陰性質粒穩轉細胞系的對照處理組間凋亡細胞數無明顯差異，表明這兩種穩轉細胞系的凋亡水平相同。而mir-153穩轉細胞系經Aβ42或H2O2處理后，其凋亡細胞數較經同樣處理的陰性質粒穩轉細胞系顯著增加，（分別為P＜0.05，P＜0.01）。

圖7 Aβ42和H2O2處理后細胞凋亡水平的檢測。*P＜0.05，＊＊P＜0.01Fig.7 The assay of apoptosis cell after Aβ42和H2O2treatment.*P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

APP是Aβ肽的前體蛋白，其表達水平的增加可直接導致Aβ肽生成增多從而成為AD的主要致病基因。而其它多方研究證明APLP2在AD的發病機制中也起著重要作用［5］。作為同一家族的成員，APP和APLP2的蛋白結構域和氨基酸序列高度相似（71％），尤其是ICD編碼區相似度更高［6］。然而，APLP2無Aβ結構域，因此Aβ肽僅由APP生成。但APP和APLP2均可經內分泌酶水解生成大小為5KD的胞內生物活性肽ICDs。經多方報道，ICDs在AD發生的早期事件中起著重要作用，如：活化GSK-3β等基因的轉錄；調節細胞凋亡水平及使細胞骨架結構發生改變等［7］。其中，最受研究人員關注的是ICDs的基因轉錄活性，但同時也是爭議的焦點。究其原因主要源于對不同細胞系及動物模型的研究導致了試驗結果間的差異性。

Tau蛋白異常磷酸化導致神經纖維纏結形成是AD的主要病理特征之一，可磷酸化Tau蛋白的激酶主要包括有GSK-3β、Cdk5、ERK等。而鑒于文獻報道，ICDs可活化GSK-3β的表達，結合本課題前期研究結果—mir-153可下調APP及APLP2的蛋白表達繼而使細胞內ICDs水平降低，因此，本文主要通過穩轉細胞系及轉基因小鼠模型來探討在高表達mir-153時GSK-3β及Tau蛋白水平的變化［5，8］。結果顯示，在mir-153穩轉細胞系中，磷酸化GSK-3β、GSK-3β總蛋白及磷酸化Tau蛋白的水平顯著降低，而Tau總蛋白則無明顯變化。第216位酪氨酸的磷酸化是GSK-3β的活化形式，磷酸化的GSK-3β及其總蛋白的降低表明在體外細胞系中，mir-153表達水平增加可導致其靶基因水解產物ICDs含量的減少、基因轉錄活性的降低從而使GSK-3β總蛋白及其激酶活性下降、Tau蛋白磷酸化水平降低，但卻不影響Tau總蛋白的表達。為進一步驗證上述結論，我們構建了mir-153轉基因小鼠，并對其腦內這兩種蛋白的表達進行了檢測。結果顯示，GSK-3β的表達與細胞試驗相一致，所不同的是在轉基因鼠腦內磷酸化Tau及其總蛋白的表達均無明顯變化，分析原因可能歸結于：機體內存在有復雜的調控機制及代償機制；除GSK-3β外，尚有其它多種激酶可催化Tau蛋白的磷酸化。

為進一步驗證mir-153靶基因下游信號分子的作用，將mir-153穩轉細胞分別經Aβ42和H2O2處理后，檢測其抗應激損傷的能力。結果顯示，應激狀態下高表達mir-153可使細胞增殖能力降低、凋亡水平增加。這與預期結果ICDs減少、細胞存活率提高相悖，然而，因一種miRNA可同時調控多種靶蛋白的表達，除APP、APLP2外，研究表明［9］mir-153尚可調控Bcl-2及Mcl-1的表達。此外，文獻報道的ICDs的促凋亡作用多鑒于對高表達ICDs片段（而非其前體蛋白）的鼠和細胞的研究，而除致病作用外，在健康個體中，APP、APLP2蛋白本身尚具有其它一些正常生理功能，如促進神經細胞的粘附、分化等，尤其值得注意的是APP水解后除可生成具有神經毒性作用的Aβ42外，尚可生成具有神經營養作用的sAPP-α，因此，不能單純的將APP定義為有害基因［10］。

綜上所述，mir-153可通過對靶蛋白APP及APLP2的調控而影響其下游信號分子GSK-3β的活性，雖然mir-153轉基因鼠腦內磷酸化TAU和總蛋白均不變，但除促進TAU磷酸化的激酶活性外，GSK-3β尚在其它一些細胞生物事件中發揮著作用，如：細胞周期的進程、細胞存活、細胞骨架的維持等［11，12］。且已經證實［5］，AD患者腦內GSK-3β的表達增加。此外，因mir-153尚可調控抗凋亡基因的表達等因素，mir-153水平增加可降低細胞抗損傷的能力。然而，這些不同靶蛋白間的協調作用尚有待進一步的研究。

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