細胞培養設備的合理使用及質量控制

王成艷 韓景田 買 霞

①武警醫學院教保處 天津 300162

細胞培養主要是指細胞在體外條件下的培養技術，亦即在無菌情況下，模擬體內生長環境，使其在體外繼續生長和增殖[1]。包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發酵工程技術等都與細胞培養有密切關系，特別是在醫藥領域的發展，細胞培養更具有特殊的作用和價值。細胞培養技術在醫學研究中得到了極為廣泛的應用，在整個生物技術產業的發展中起到了很關鍵的核心作用。掌握細胞培養技術對臨床醫學各領域的學習和研究大有幫助。除潔凈的室內環境外，與細胞培養技術有關的設備和器材主要有二氧化碳培養箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌器、濾菌器及玻璃器皿等。結合我們的工作實踐，談談細胞培養設備的合理使用及質量控制。

1 CO2培養箱

CO2培養箱價格昂貴，溫度和氣體濃度傳感器靈敏，如果在使用過程中操作不當，容易導致儀器損壞，影響正常工作和儀器使用壽命。CO培養箱內的進氣壓要求為0.06 MPa。開門后，箱內氣體散發,壓力下降。關門后氣體傳感器在低壓刺激下有節奏地開閉，向箱內充氣，當進氣壓達到0.06 MPa時,自動停止調節。因此，在日常使用過程中，盡量避免不必要的打開培養箱，從而減少傳感器的工作負荷，延長其使用壽命[2]。放置CO2培養箱的實驗室室溫應保持在25 ℃左右，溫度過高會影響CO2培養箱的溫控裝置。CO2培養箱使用過程中，要求在箱內托盤中放一定量的滅菌水，使箱內為飽和濕度環境，這是針對開放培養細胞要求設計的，有利于細胞生長[3]。使用CO2培養箱培養細胞時，要每天觀察二氧化碳壓力表，及時更換二氧化碳鋼瓶。培養箱內應放置一溫度計，記錄其溫度與指示表溫度是否一致。箱內應劃分不同區域,不同細胞應放不同區域[4]。此外，CO2培養箱的箱內要經常消毒，以免細菌污染，影響細胞培養。

2 倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統顛倒，用于觀察培養的活細胞。倒置顯微鏡和放大鏡起著同樣的作用，就是把近處的微小物體成一放大的像，以供人眼觀察。只是顯微鏡比放大鏡可以具有更高的放大率而已。倒置顯微鏡中最常用的觀察方法就是相差。由于這種方法不要求染色，是觀察活細胞的理想方法。應嚴格按照有關操作規則使用顯微鏡，避免因使用不當造成損毀。觀察細胞時，按照先低倍后高倍的物鏡選擇方法，每次使用完畢后應及時做好清潔工作[5]。所有鏡頭表面必須保持清潔，落在鏡頭表面的灰塵，可用吸耳球吹去，也可用軟毛刷輕輕的撣去掉。當鏡頭表面沾有油污或指紋時，可用脫脂棉蘸少許無水乙醇和乙醚的混合液（3∶7）輕輕擦拭。不能用有機溶液清擦其它部件表面，特別是塑料零件，可用軟布蘸少量中性洗滌劑清擦。在任何情況下操作人員不能用棉團、干布塊或干鏡頭紙擦試鏡頭表面，否則會刮傷鏡頭表面，嚴重損壞鏡頭，也不要用水擦試鏡頭，這樣會在鏡頭表面殘留一些水跡，而滋生霉菌，嚴重損壞顯微鏡。觀察細胞生長狀態時，要輕拿輕放，防止細胞被顯微鏡污染或損壞鏡頭。

3 超凈工作臺

超凈工作臺是一種局部層流裝置，提供局部高潔凈度環境，使工作環境無菌無塵的一種空氣凈化設備。為了保證超凈化工作臺的潔凈度，使用前30 min應開啟風速開關和紫外線開關，進行紫外線照射,以保證操作區有潔凈空氣環境，包括移液器、試管架、鑷子等。超凈臺內也應劃分不同的區域,如材料區、操作區、污物區等。注意安全,特別是酒精燈,如有酒精漏出應立即吸干擦凈,以免發生意外。實驗完畢,所用過的器皿、雜物必須清理,同時進行臺面清潔，使工作臺處于最佳狀態，同時定期拆洗或更換預過濾器中的無紡布濾料。經常用酒精或丙酮等擦拭紫外線燈管，保持表面清潔，否則影響殺菌能力[6]。

4 高壓蒸汽滅菌器

高壓蒸汽滅菌的效果直接影響細胞培養時細胞的生長狀況。滅菌不當，容易造成細菌對培養細胞的污染。滅菌器內,裝放擬滅菌物品不應過擠,其總體積不應超過其容積的80%，物品裝放時，上下左右均應互相間隔一定距離，以利于蒸汽與空氣相互交換，,難于滅菌的大物品放上層，較易滅菌的小物品放在下層。滅菌前應對滅菌器各部位進行常規檢查。滅菌時，當壓力指示表升至0.35 kg/cm2時，開放排氣閥，排凈冷空氣后再關閉，以使滅菌器內真正達到預定的溫度。否則壓力表上所示壓力并非全部蒸汽壓，滅菌將不完全。滅菌完畢后，不可突然開大排氣閥門排氣減壓，以免因器內壓力驟然下降而瓶內液體沸騰，沖出瓶外。

5 濾菌器

細胞培養時，對培養基的除菌方法通常采用濾菌器除菌，即采用濾膜濾器除菌。濾膜濾器是用金屬容器將孔徑不同的醋酸纖維薄膜（濾膜）夾在中間，進行過濾除菌。常用的濾膜的規格有0.22 um、0.35 um、0.45 um、0.65 um、0.8 um等幾種。使用時，先將濾膜放入雙蒸水中浸泡12 h以上，平鋪于金屬濾器上。為防止濾膜破損，通常使用雙層濾膜，上層使用孔徑大一點的濾膜（0.45 um），下層使用孔徑小一點的濾膜（0.22 um）。固定好后，連同使用的膠管用牛皮紙包好，經高壓滅菌1.04 kg/cm215 min，備用。新濾器應在流水中徹底洗滌后放在1∶100的鹽酸中浸泡數小時，再用蒸餾水洗滌，干燥后保存。

6 玻璃器皿

培養用的各種玻璃器皿如玻璃瓶、培養瓶、培養皿、吸管等均需經過清水浸泡、去污刷洗、酸浸和沖洗以及高壓滅菌等程序。清洗玻璃器皿要求干凈透明、無油跡，不能殘留任何物質。因為某些化學物質僅百萬分之一毫克，就會對細胞產生毒性作用。玻璃器皿清洗方法：新的或用過的玻璃器皿要先用清水浸泡，軟化和溶解附著物。新玻璃器皿使用前先用自來水簡單刷洗，再用5%鹽酸浸泡過夜，后用試管刷刷洗，但細胞培養瓶不能刷。將初洗的玻璃器皿放在烘箱中烘干后，放入濃硫酸重鉻酸鉀配制的洗液中至少過夜。手工洗滌浸酸后的器皿，每件器皿至少要反復“注水－倒空”10次以上，最后用雙蒸水浸洗2～3次，烘干，包裝，高壓滅菌121 ℃、30 min后備用。

[1]盧圣棟.現代分子生物學實驗技術(第二版)[M].北京:中國協和醫科大學出版社,1999:430.

[2]趙巍,李小寧.CO2培養箱的使用,保養及故障排除[J].醫療設備信息,2006,21(6):97-98.

[3]張麗蕓,盧曉,程寶鸞.二氧化碳培養箱的使用和保護[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊,2005,26(1):61.

[4]崔冬生,李增寧,顧平,等.細胞培養室管理規則[J].華北煤炭醫學院學報,2004,6(3):395-396.

[5]韓景田,賀智,王剛.顯微鏡的調試使用和管理[J].中國醫學裝備,2009,6(1):61-62.

[6]劉金芳.凈化工作臺及壓力滅菌器的質量控制[J].江蘇預防醫學,2000,11(4):65-66.