牛乳中β-內酰胺酶的檢測方法研究進展

張鑫瀟，謝巖黎，王金水，嚴瑞東

（河南工業大學糧油食品學院，鄭州450052）

牛乳中β-內酰胺酶的檢測方法研究進展

張鑫瀟，謝巖黎，王金水，嚴瑞東

（河南工業大學糧油食品學院，鄭州450052）

β-內酰胺酶可以水解生鮮奶中β-內酰胺類抗生素，使檢測方法無法正確判斷其是否為“無抗奶”，掩蓋抗生素超標的事實。對牛乳中β-內酰胺酶的結構、殘留的現狀和危害、檢測方法的研究進展進行綜述。

β-內酰胺酶；生鮮奶；檢測方法

0 引言

奶制品中抗生素殘留的問題是牛奶及其制品質量安全中的重點問題。有關抗生素殘留的檢測方法日趨完善，但是一些不法分子為了逃避抗生素的檢測，向牛奶內添加β-內酰胺酶（β-lactamase），可以使β-內酰胺類抗生素如常用的青霉素降解，使微生物法、酶聯免疫法等常規的檢測方法失效，從而無法正確判斷是否為“無抗奶”，掩蓋抗生素超標的事實。

2009年2月4 日，根據衛生部等九個部門《關于開展全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治的緊急通知》的規定，為配合全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治工作的深入開展，專項專家委員會提出《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第二批）》，其中就包括β-內酰胺酶。

1 牛乳中β-內酰胺酶潛在危害及殘留現狀

β-內酰胺酶是細菌產生的一種能水解β-內酰胺類抗生素的酶。已發現二百多種β-內酰胺酶。其中比較有代表性的青霉素酶，即能催化水解青霉素β-內酰環產生青霉噻唑酸的一類β-內酰胺酶。青霉素酶根據Bush-Jacoby-Medeiros最新分類法[1]，以底物譜和抑制劑不同可分為四組，按各自氨基酸和核苷酸序列屬于A、B、C、D四類。第一組為頭孢菌素酶（AmpC酶），不被克拉維酸抑制，分子類別屬于C類，本組酶大部分由染色體介導，也可由質粒介導[2-5]；第二組β-內酰胺酶數目最多，如青霉素酶和超廣譜酶，可被克拉維酸抑制，多由質粒介導，其中除碳青霉烯類水解活性分屬2 d亞組為D類，其他皆為A類；第三組為金屬β-內酰胺酶，分子類別為B類，不被克拉維酸抑制，但可被EDTA抑制；第四組為其它不能被克拉維酸完全抑制的青霉素酶，分子類別未定[6]。現今已分離出多種類型的青霉素酶，白色粉末狀，分子量50 ku，溶于水，酶溶液易失活，酶反應最適pH值為6.0～6.5，以青霉素G鉀鹽為底物，酶促中反應速率為半最大值時，底物濃度為4.32×10-3mol/L（5/B酶），4.89×10-3mol/L（569酶）。醫療上用于青霉素過敏癥的治療，在實驗中青霉素酶用于破壞或抑制青霉素活性。

在β-內酰胺類抗生素大量存在的環境中，有些微生物可以產生β-內酰胺酶[7]，催化β-內酰胺開環降解，使抗生素水解失活[8]。因此，細菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥性，主要是細菌在接觸藥物后，通過質粒或染色體介導發生基因突變產生的[9]。但是由此產生的β-內酰胺酶含量很低，在不人為添加β-內酰胺酶的條件下是無法檢測到微生物產生的β-內酰胺酶的。究其原因可能是由于采奶方式、牛奶的組分、消毒方法和包裝儲存方法等不適于產β-內酰胺酶微生物的生存，基于目前科研的認識和實踐，牛奶中檢出的β-內酰胺酶是人為添加[10]。

有觀點認為，正是假“無抗奶”的存在催生了國家嚴禁“無抗奶”標識政策的出臺。β-內酰胺酶的使用會助長牛奶生產中β-內酰胺類抗生素的濫用，然而β-內酰胺酶殘留危害如何如今還未定論。

β-內酰胺類抗生素以青霉素為例，青霉素的過敏反應非常普遍，約0.7～10%的患者對青霉素過敏，占過敏病人的74%。過敏反應是青霉素中所含的一些雜質引起的，引起過敏反應的基本物質有兩種，一種是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，與蛋白質結合形成抗原而致敏。另一種過敏源是一些高聚物，為β-內酰胺環開環后自身聚合而成，聚合程度越高，過敏反應越強。而青霉素在β-內酰胺酶作用下，酶中親核性基團向β-內酰胺環進攻，開環后可脫羧重排生成中間體青霉噻唑酸[11，12]。雖然由于添加β-內酰胺酶造成青霉素過敏的病例并未被研究證明，但根據青霉素的過敏機理，以及β-內酰胺酶的添加可能會造成β-內酰胺類抗生素耐藥性的原因，確實應該對β-內酰胺酶的濫加提高警惕，嚴加管理。

由于抗生素殘留的普遍性，而國家又明文規定了抗生素殘留不能超量，“無抗”又成為乳制品的重要質量指標，因此出于逃避檢測等各種目的，假“無抗奶”的出現令人擔憂[13]。中國藥品生物制品檢定所的崔生輝等人在2006年對從零售市場上隨機采集的5個廠家生產的38份牛奶樣品進行了分析，結果38份市售牛奶樣品63.2%(24/38)檢出β-內酰胺酶[14]。由此可見β-內酰胺酶的濫用情況非常普遍。

2 β-內酰胺酶的檢測方法

2.1 微生物法

用微生物法對β-內酰胺酶檢測，最先是在臨床醫學上應用的。

臨床微生物實驗室為了了解細菌的耐藥機制及指導臨床合理使用抗生素、延緩細菌耐藥性的產生、控制耐藥菌株的播散和流行以及研究、開發新型、穩定和高效的抗生素，采用了多種微生物法對產β-內酰胺酶的耐藥菌株進行密切監測[15]，主要方法有：顯色培養基法[16]、三維試驗法[17]、紙皮擴散確認法[18]、聚合酶鏈式反應法[19]等。

2007年中國藥品生物制品檢定所的崔生輝等人通過青霉素分解實驗和蛋白電泳實驗分析“生鮮牛乳抗生素分解劑”的有效成分，結果證實β-內酰胺為其主要的成分。然后運用β-內酰胺酶特異性抑制劑舒巴坦建立了該酶的檢測方法。該方法在牛奶中的檢出限為4 U/mL β-內酰胺酶[14]。其所用的方法主要是運用微生物培養法，基本原理是利用克拉維酸、舒巴坦的特異性抑制β-內酰胺酶的特點做細菌培養，通過測量抑菌圈得出結果。該方法可以檢測出牛奶中未反應完全（未失活）的β-內酰胺酶，可用于檢測未經過任何加工的牛奶。檢出限較低。北京先驅威峰技術開發公司開發的ZY-400系列β-內酰胺酶測量分析儀也是根據微生物培養法的原理檢測乳與乳制品中的舒巴坦敏感β-內酰胺酶類物質。

2.2 碘量法

碘量法是氧化還原滴定法中，應用比較廣泛的一種方法。β-內酰胺環是該類抗生素的結構活性中心,其性質活潑,是分子結構中最不穩定的部分,其穩定性與含水量和純度有很大關系，β-內酰胺環不穩定是因為，元環張力大和內酰胺鍵易水解[19]。利用青霉素分子不消耗碘,而其降解產物青霉噻唑酸消耗碘的性質,采用碘量法測定。

Sykes和Nordstrom用碘量法檢測β-內酰胺酶的活性，脫色反應緩慢，青霉素需反應徹底，15～20 min后達到穩定狀態，并檢測該反應過程的吸光率變化，該實驗的檢測限可以達到0.001 U[20，21]。南昌大學的薛哲等人在對β-內酰胺類抗生素對熱的穩定性的研究中，利用青霉素或頭孢菌素不消耗碘，而其降解產物消耗碘的性質，采用剩余碘量法測定，以標準對照法計算含量[22]。

北京六角體科技發展有限公司β-內酰胺酶快速檢測試劑盒原理為牛奶中的β-內酰胺酶與試劑反應后產生的水解物，再與鑒別試劑反應，觀察是否生成藍色物質，可以鑒別牛奶中是否含有β-內酰胺酶，只適用于生鮮奶，檢測下限為50 U/mL以上（酶活性）。

碘量法可檢出牛奶中已反應及未反應的β-內酰胺酶，可用于檢測鮮奶及奶制品中的β-內酰胺酶，檢出限較高。

2.3 酸測定法

是根據青霉素或頭抱菌素經β-內酰胺酶作用產生裂解酸引起pH值變化,使指示劑色變或碳酸鈉溶液釋放出二氧化碳的壓力變化及以堿滴定來設計的。

Richard J.Henry和Riley D.Housewright[23]早在1946年的時候利用壓力測量計，根據青霉素酶分解青霉素產生中間產物青霉酸，然后分解得二氧化碳和青霉噻唑酸的原理，測得二氧化碳的變化量計算β-內酰胺酶的含量。

在醫學和獸藥研究方面，酸測定法應用于對阿莫西林、氨芐西林等β-內酰胺類抗生素耐藥菌株的檢測。張春輝、張曉根與胡功政以酚紅為指示劑，用酸測定法對耐藥菌株檢測，陽性率為97%[24]。

首都師范大學化學系的馬潔與李孝君等人，根據酸測定法原理，利用酸度計檢測牛奶中β-內酰胺酶的殘留量。該方法在磷酸緩沖液和牛奶中，對β-內酰胺酶的檢出限分別為10 U/mL和15 U/mL，同時得到的米系常數為0.0351 mmol/L[25]。

2.4 液相、氣相法檢測

衛生部發布的《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第二批）》中包括β-內酰胺酶，其檢測方法是由中國檢驗檢疫科學院食品安全所提供，推薦使用液相色譜法。

在β-內酰胺類抗生素生產過程中，需對副產物青霉噻唑酸加以控制，利用高效液相色譜法可以直接檢測重組菌中是否含有青霉素酶。中國科學院大連化學物理研究所的趙靜枚、都絳瑛與張銘俊利用高效液相色譜法對青霉噻唑酸進行了液相色譜的定性檢測，結果表明實驗方法簡便快速，結果準確[26]。

農業部食品質量監督檢驗測試中心的韓奕奕與王建軍等人，用加標的方法制備含不同濃度β-內酰胺酶的還原乳，氣相色譜-質譜聯用法按國標GB/T22388-2008操作。用SNAP雙流向酶聯免疫間接檢測法對牛奶中β-內酰胺酶的檢測限可以達到0.0005 U/mL和0.001 U/mL。此法可以作為快速檢測牛奶中β-內酰胺酶的快快速篩選方法，有較高的精確度和靈敏度[27]。

3 β-內酰胺酶檢測的研究現狀及展望

β-內酰胺酶的檢測方法有微生物法、分光光度法、高效液相色譜法、氣質聯用法等。微生物法周期長，分光光度比色法易受干擾，酸測定法中，根據壓力變化測定的檢測法費時冗長、操作較繁,影響因素多,又需特殊設備,很少使用。而利用pH值變化測定的檢測法則簡單易行,重復性較好,最易獲取結果,且較靈敏,穩定性好,但也存在假陽性和假陰性的問題，適用于大多數實驗室，特別是基層檢測。液相色譜和氣相色譜法是國標，具有檢測精度高,檢測限低，重復性好的優點，但是也存在樣品前處理步驟繁瑣、費時、檢測儀器昂貴、周期長、成本高，且依賴專業技術人員等問題，不利于基層質檢部門作為大面積初篩、不利于現場快速檢測和監督，也不利于指導消費者家庭內對牛奶的選擇性識別。建立一種簡便、快速、高效、成本低廉β-內酰胺酶試紙檢測技術具有重要意義。

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Research on analytical methods of β-lactamase residue in milk

ZHANG Xin-xiao，XIE Yan-li，WANG Jin-shui，YAN Rui-dong
(School of Food Science and Technology Henan University of Technology,Zhengzhou 450052，China)

β-lactamase can hydrolyze β-lactam antibiotics,which cause failure analysis of antibiotics.Then we can't estimate which is antibiotic-free milk.This paper reviews the construction,current residue situation,hazard and the methods of identification.

β-lactamase；Raw milk；Analytical methods

TS252.7

B

1001-2230（2011）02-0045-03

2010-05-24

張鑫瀟（1986-），女，碩士研究生，研究方向為食品質量與安全。