煙草基因組學(xué)研究方法篇：5.煙草蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法和應(yīng)用

王紹美

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

蛋白質(zhì)組（proteome）最初指細胞內(nèi)全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式，后引申指一個基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組研究是生命科學(xué)研究進入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一和功能基因組學(xué)研究的新興學(xué)科、熱點領(lǐng)域。蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法主要是基于蛋白質(zhì)樣品的分離、蛋白質(zhì)的鑒定及蛋白質(zhì)間的相互作用等技術(shù)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法

1.1 蛋白質(zhì)的分離技術(shù)

用于蛋白質(zhì)分離的技術(shù)有雙向電泳（two-dimensional electrophoreisis,2-DE）、熒光差異雙向凝膠電泳（two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）、高效液相色譜（RP-HPLC）、毛細管電泳（capillary electrophoresis,CE）、多維液相色譜（MDLC）等技術(shù)。其中最主要的技術(shù)是雙向電泳和高效液相色譜。2-DE基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點和分子量大小不同，先后在兩個方向上分離蛋白質(zhì)復(fù)雜組分[1]。這種技術(shù)具有分辨率和靈敏度較高，可用于計算機定量分析差異表達蛋白質(zhì)，用高靈敏度微量化學(xué)方法較易對2-DE膠上的分離蛋白質(zhì)進行鑒定和表征的特點，因此，目前仍是蛋白質(zhì)分離的核心技術(shù)，適宜于進行比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。該技術(shù)的缺點是疏水性蛋白（如膜蛋白）難溶于樣品緩沖液；高分子量蛋白、極酸和極堿性蛋白易在電泳中丟失；低豐度（拷貝數(shù)小于1000）蛋白無法檢測等。RP-HPLC作為蛋白質(zhì)分離和純化的最常用方法，一般是將液相色譜分離技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，首先酶解混合蛋白，再經(jīng)過適當(dāng)?shù)纳V分離，并通過串聯(lián)質(zhì)譜分析肽段、鑒定蛋白。這項技術(shù)將色譜與質(zhì)譜結(jié)合實現(xiàn)了高通量篩選和進行蛋白質(zhì)混合物鑒定，操作過程簡單、分析速度快、分離能力好、靈敏度高，能富集低豐度蛋白，可迅速、完全自動化鑒定極微量蛋白質(zhì)，但不適用比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.2 蛋白質(zhì)的鑒定技術(shù)

用于蛋白質(zhì)鑒定的技術(shù)主要有傳統(tǒng)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)、生物質(zhì)譜鑒定（mass spectrometry,MS）技術(shù)和同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽法（isotope-coded affinity tags,ICAT）。傳統(tǒng)蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)指Edman降解法測N端序列和氨基酸組成分析法，前者有測定速度較慢，費用偏高，靈敏度低等缺點；后者因耗資低而常用于蛋白質(zhì)的鑒定。MS技術(shù)因其具有高通量、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、易于自動化、快速等優(yōu)點，適用于分析凝膠上的微量蛋白，成為蛋白質(zhì)鑒定的主要支撐技術(shù)。該技術(shù)基本原理是先使蛋白質(zhì)樣品分子離子化，然后根據(jù)不同離子之間的質(zhì)荷比（m/z）差異來分離并確定蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量，再根據(jù)蛋白質(zhì)酶解后所得到的肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）、肽序列標(biāo)簽（PST）和肽階梯序列（PLS）去檢索蛋白質(zhì)或核酸序列庫[2]。生物質(zhì)譜分析系統(tǒng)根據(jù)離子源不同分為基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）。ICAT是采用同位素標(biāo)記多肽或蛋白質(zhì)的親和標(biāo)簽技術(shù)，具有靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點，能用于快速定性和定量鑒定疏水性和低豐度蛋白質(zhì)，并可直接測試混合樣品，進行差異表達蛋白質(zhì)研究。

1.3 蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)

應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)有酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2Z）系統(tǒng)、噬菌體展示（phage display）技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片（protein chip）技術(shù)、基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法等。酵母雙雜交系統(tǒng)技術(shù)原理是在真核模式生物酵母中，當(dāng)靶蛋白和誘餌蛋白特異結(jié)合后,形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，誘導(dǎo)已知基因的啟動子，從而啟動報告基因在酵母細胞內(nèi)的表達，通過檢測該基因表達產(chǎn)物而判別誘餌蛋白和靶蛋白之間是否存在相互作用。該技術(shù)具有易于自動化高通量等特點，已成為研究蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能、繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜的重要手段，但分析過程中存在假陽性和假陰性的現(xiàn)象。噬菌體展示技術(shù)是在編碼噬菌體外殼蛋白的pⅢ或pVⅢ基因上連接一個單克隆抗體基因序列的技術(shù)。噬菌體生長時表面表達出的相應(yīng)單抗在過柱時，目的蛋白質(zhì)可特異性結(jié)合相應(yīng)抗體。該技術(shù)具有高通量及簡便的特點，它可以檢測出酵母雙雜交技術(shù)檢測不出的本身具有激活轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)酶聯(lián)免疫分析技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當(dāng)與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性和定量分析。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法在煙草中的應(yīng)用

2.1 應(yīng)用于基礎(chǔ)研究

煙草作為模式生物應(yīng)可用于蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。煙草的Bright-Yellow-2（BY2）細胞系是從煙草幼苗愈傷組織中獲得的，該細胞系具有快速生長、易于遺傳轉(zhuǎn)化、細胞分裂同步等優(yōu)點，是目前植物基礎(chǔ)研究領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的細胞系之一。Duby等[3]以BY2細胞系作為實驗材料，構(gòu)建了可供蛋白質(zhì)快速網(wǎng)上鑒定和蛋白質(zhì)圖譜比對的BY2細胞系蛋白質(zhì)組參考圖譜。2008年，Gerber等[4]在煙草BY2細胞系中研究了細菌脂多糖誘導(dǎo)的細胞靶點信號蛋白質(zhì)組圖譜。Goulet等[5]用Nicotiana benthamiana葉片研究質(zhì)外體蛋白質(zhì)組的結(jié)果，將成為植物與病菌互作或細胞壁代謝以及細胞壁分泌蛋白研究的有用工具。

2.2 應(yīng)用于逆境脅迫研究

煙草在生長過程中遭受的各種生物脅迫和非生物脅迫會造成煙葉產(chǎn)量、質(zhì)量下降，這些逆境脅迫會通過逆境感知信號來調(diào)控細胞內(nèi)抗逆相關(guān)蛋白質(zhì)的合成表達，以調(diào)整自身生理狀態(tài)和外部形態(tài)適應(yīng)外界環(huán)境變化。為了解釋煙草抗逆機制、提高煙草抗逆性，Pineda等[6]、Razavizadeh等[7]、Dani等[8]、王紹美[9]、蓋英萍[10]、梁景霞[11]分別對生物脅迫和非生物脅迫下煙草蛋白質(zhì)組進行了研究。

2.3 應(yīng)用于代謝調(diào)控途徑研究

煙草的代謝調(diào)控直接影響煙葉的化學(xué)成分協(xié)調(diào)，從而影響煙葉內(nèi)在品質(zhì)。2010年，Kaida等[12]研究了紫色酸性磷酸酶在煙草細胞壁蛋白質(zhì)去磷酸化中的潛在作用；Chivasa等[13]對信號調(diào)節(jié)物 eATP的影響展開了代謝調(diào)控蛋白質(zhì)組研究。2009年，Millar等[14]開展了煙草細胞系形成次生壁的細胞壁和分泌蛋白質(zhì)組研究。王茂等[15]進行了信號誘導(dǎo)物結(jié)合栽培措施的代謝調(diào)控研究。

2.4 不同生態(tài)類型煙葉香氣風(fēng)格形成機理研究

我國生產(chǎn)的煙葉因生態(tài)條件的影響而具有不同的香氣風(fēng)格，運用蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以探討煙草應(yīng)答不同生態(tài)條件的分子機理和不同生態(tài)類型形成不同香氣風(fēng)格的機理[16]。

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