反向遺傳操作技術(shù)在豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

郭泗虎，曹宗喜，2，李海琴，閆明菲，亓文寶，焦培榮，張桂紅

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642；2.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，海南 海口571100）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起豬的一種高度傳染性疾病。該病自1987年首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已遍及世界各個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家［1］，它所引發(fā)的母豬流產(chǎn)和仔豬的呼吸障礙給養(yǎng)豬業(yè)造成了災(zāi)難性的打擊。特別是2006年以來(lái)，變異株P(guān)RRSV的出現(xiàn)則對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響［2］。

本文從PRRSV疫苗情況、PRRSV反向遺傳系統(tǒng)的介紹、反向遺傳操作技術(shù)對(duì)病毒致弱作用的研究、反向遺傳操作技術(shù)在基因缺失標(biāo)記疫苗的研究這4個(gè)方面就反向遺傳操作技術(shù)在PRRSV疫苗研發(fā)中的應(yīng)用做一綜述。

1 PRRSV疫苗

目前普遍應(yīng)用兩種商品化疫苗來(lái)預(yù)防和控制PRRSV，分別是減毒活疫苗MLV（又稱(chēng)弱毒苗）和滅活苗。弱毒苗從1994年應(yīng)用以來(lái)，對(duì)同源株具有有效的保護(hù)效力，但對(duì)異源株的保護(hù)作用不明顯。當(dāng)前所使用的 MLV面臨許多問(wèn)題［3］：疫苗株易失活，存在持續(xù)感染性，不完全的保護(hù)力及毒力返祖等。實(shí)驗(yàn)性的亞單位疫苗是利用質(zhì)粒、細(xì)菌、桿狀病毒、偽狂犬病病毒、腺病毒等為載體攜帶包括GP5，M和GP3等幾種抗原而發(fā)展起來(lái)的對(duì)抗PRRSV的疫苗［4］。在這些亞單位疫苗中，利用GP5串聯(lián)M或GP3的多抗原疫苗免疫動(dòng)物后能產(chǎn)生較高的中和抗體和較強(qiáng)的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，但這些亞單位疫苗是否比現(xiàn)有的MLVs或滅活苗的免疫效果好還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 PRRSV反向遺傳系統(tǒng)

RNA 病毒的反向遺傳學(xué)研究是從病毒基因組入手研究基因的結(jié)構(gòu)與功能、研究病毒的致病機(jī)理以及其他相關(guān)內(nèi)容。其核心是建立病毒的感染性克隆，并通過(guò)一定的方法和途徑實(shí)現(xiàn)病毒的遺傳拯救，即病毒的人工構(gòu)建。

目前PRRSV反向遺傳操作技術(shù)具體方法大致有兩種，第一種方法是RNA病毒基因組先經(jīng)過(guò)反轉(zhuǎn)錄成為病毒cDNA，接著克隆到合適的轉(zhuǎn)錄表達(dá)載體上，克隆到轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游，在體外轉(zhuǎn)錄合成病毒的基因組RNA，然后再將這些體外轉(zhuǎn)錄本轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使之在宿主細(xì)胞內(nèi)包裝形成具有感染性的病毒粒子，最后從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收病毒，得到感染性分子克隆。歐洲型代表株LV和北美型代表株VR－2332的全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建都是基于這種方法建立起來(lái)的［5－6］。T7或SP6啟動(dòng)子插入全長(zhǎng)病毒基因組cDNA的前端來(lái)驅(qū)動(dòng)病毒的體外轉(zhuǎn)錄［6－7］。目前，這種方法已成功拯救出兩種不同基因型PRRSV，并且廣泛應(yīng)用于病毒基因組功能的研究上。另一種方法是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄的cDNA克隆到表達(dá)載體上獲得具有感性的cDNA，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成具有感染性的病毒RNA，獲得重組病毒。Huang［8］等用該系統(tǒng)拯救出表達(dá)GFP的PRRSV，通過(guò)測(cè)定GFP在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)水平及拯救病毒的滴度來(lái)研究病毒的拯救效率。結(jié)果表明，與第一種方法相比，其拯救效率高10～50倍。利用改進(jìn)的這種方法，繞過(guò)RNA體外轉(zhuǎn)錄這一步驟，使得研制疫苗MLV的過(guò)程大大減低了成本和節(jié)省了時(shí)間。

3 反向遺傳操作技術(shù)與病毒致弱

了解PRRSV致病機(jī)理是研制致弱疫苗的關(guān)鍵。Kwon［9］等將構(gòu)建的致弱疫苗株的全長(zhǎng)感染性cDNA克隆的特定區(qū)域與高致病性毒株的感染性cDNA克隆的同等區(qū)域進(jìn)行置換，然后再分別將嵌合構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入細(xì)胞拯救出變異毒株，并接種懷孕母豬。結(jié)果顯示，NSP3－8和ORF5可能包含主要的毒力決定區(qū)，NSP1－3，NSP10－12及 ORF2等區(qū)域與毒力相關(guān)。于此類(lèi)似，Wang［10－11］等利用兩株不同類(lèi)型的PRRSV毒株（減毒Ingelvac PRRS MLV和MN184毒株）成功構(gòu)建了嵌合的PRRSV感染性cDNA克隆，這兩種互補(bǔ)嵌合的cDNA克隆分別用一毒株基因組的5′－UTR／ORF1與另一株的ORF2－7／3′－UTR 融 合。以 Ingelvac PRRS MLV 株 5′－UTR／ORF1為骨架的嵌合毒組表現(xiàn)出與親本毒株相似的抗體反應(yīng)，但與MN184組相比致病性減弱。它與以Ingelvac PRRS MLV株為骨架嵌入MN184株的ORF5－6而構(gòu)建的嵌合體相似，分別能夠保護(hù)豬只免受變異株SDSU73和JA142的攻擊。此外，Gudmundsdottir［12］等用嵌合病毒在體外感染PAM來(lái)評(píng)價(jià)毒力影響因子對(duì)宿主免疫反應(yīng)的影響，表明位于ORF1a區(qū)域的NSP1－8發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

以上結(jié)果表明，與利用細(xì)胞傳代培養(yǎng)而獲得減毒疫苗株的傳統(tǒng)方法相比，應(yīng)用嵌合感染性cDNA克隆技術(shù)與野毒株基因組的ORF5－6區(qū)域進(jìn)行簡(jiǎn)單置換可以較快的致弱病毒毒力，同時(shí)，這個(gè)新的嵌合毒還能夠提高疫苗對(duì)變異株的保護(hù)效力。至于Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV毒株之間的區(qū)域進(jìn)行置換構(gòu)建嵌合病毒還有待于進(jìn)一步研究。

4 反向遺傳操作技術(shù)與基因缺失標(biāo)記疫苗

利用血清學(xué)的檢測(cè)方法不能區(qū)分疫苗免疫豬和自然感染豬是當(dāng)前弱毒苗的最大應(yīng)用缺陷，而用反向遺傳操作技術(shù)對(duì)病毒基因組特定區(qū)域進(jìn)行缺失，進(jìn)而構(gòu)建新的標(biāo)記疫苗或鑒別疫苗，這在控制和最終凈化PRRSV方面具有重要價(jià)值。由于Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV基因組的NSP2區(qū)域都能夠耐受大片段缺失，并且這些缺失區(qū)域具有一些與免疫優(yōu)勢(shì)相關(guān)的 B 細(xì)胞表位［13－14］。de Lima［15－16］等將 NSP2區(qū)缺失了一處B細(xì)胞表位的PRRSV變異株免疫接種懷孕母豬，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性N蛋白抗體，但不能夠產(chǎn)生針對(duì)缺失表位的特異性抗體，能夠利用針對(duì)缺失表位的特異性ELISA方法進(jìn)行能分區(qū)疫苗免疫豬和自然感染豬，且突變毒株與親本毒表現(xiàn)出相類(lèi)似的毒力表型。這表明NSP2區(qū)域可以作為標(biāo)記性的抗原表位的缺失區(qū)域。

Kim［17］等用NSP2區(qū)缺失了免疫表位ES4表達(dá)GFP的Ⅰ型PRRSV株感染保育豬21d后，所產(chǎn)生的抗N蛋白抗體的水平與親本的重組病毒相似；與親本毒株相比，表達(dá)GFP的突變株毒力減弱，并表現(xiàn)出較輕的病毒血癥。ELISA檢測(cè)表明，接種了突變株的豬只不能夠產(chǎn)生對(duì)抗缺失表位的抗體，在感染14d后可以檢測(cè)到針對(duì)GFP的抗體；但重組EGFP的毒株在細(xì)胞傳代中EGFP熒光逐漸消失［18］，說(shuō)明在NSP2區(qū)域引入標(biāo)記位點(diǎn)缺乏遺傳穩(wěn)定性。

Fang［18］等對(duì)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，ES4表位在Ⅰ型PRRSV株的NSP2序列中是高度保守的，用4株具有代表性的Ⅰ型PRRSV野毒株感染豬只后，并利用針對(duì)ES4表位的特異性ELISA方法可檢測(cè)出抗ES4抗體，這表明ES4表位缺失毒株可以用來(lái)作為一種PRRSV的標(biāo)記疫苗，用以區(qū)別Ⅰ型PRRSV野毒株。但對(duì)Ⅰ型和Ⅰ型PRRSV基因序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，ES4表位并不是保守的，因此基于Ⅰ型PRRSV ES4表位設(shè)計(jì)的區(qū)分疫苗免疫和自然感染的方法不適用于Ⅱ型PRRSV疫苗的區(qū)分。但這為將來(lái)合理設(shè)計(jì)PRRSV基因缺失疫苗及其相應(yīng)的檢測(cè)方法具有借鑒意義［16，18］。

5 結(jié)語(yǔ)

反向遺傳操作技術(shù)不僅為研究病毒蛋白在PRRSV復(fù)制及其致病性作用方面提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，而且在研制MLVs方面拓寬了視野，即通過(guò)對(duì)病毒基因組進(jìn)行操作，旨在獲得變異致弱株來(lái)達(dá)到研制MLVs的目的。這種疫苗能夠有效的誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，增強(qiáng)了對(duì)這種疾病的保護(hù)力。與傳統(tǒng)的由細(xì)胞連續(xù)盲目傳代獲得的MLVs相比，這種疫苗更加安全和可靠。在研制有效的亞單位疫苗和基于反向遺傳技術(shù)MLVs方面，面臨的最主要限制還是世界范圍內(nèi)PRRSV遺傳多樣性。而目前基于反向遺傳技術(shù)的疫苗大多數(shù)都是基于PRRSV的單一毒株制成的，這樣的疫苗對(duì)野毒株能否提供完全保護(hù)力仍需要進(jìn)一步研究。

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