胚胎干細胞的代謝組學方法在毒理學中的應用進展

周會芳，王 麗，張艷軍，邊育紅

(天津中醫藥大學中藥學院，天津市現代中藥重點實驗室，省部共建國家重點實驗室培育基地，天津市中藥化學及分析重點實驗室，天津 300193)

毒理學是研究外源化合物對生物體損害作用的一門學科，隨著科學技術的發展，新化學物質日益增多，傳統的毒理學評價方法存在成本高，周期長，敏感度低等諸多不足。胚胎干細胞最早是由1981年Evans和Martin分別從小鼠早期胚胎中分離培養成功并建立細胞系，1998年美國威斯康星大學的Thomson和約翰斯霍普金斯醫學中心的Gearhart成功的分離培養出人胚胎干細胞(human Embryonic Stem Cell，hESC)并在體外成功建系，使得胚胎干細胞再次成為研究的熱點。

代謝組學是20世紀90年代后期發展起來的一門新興學科，它是繼基因組學，轉錄組學和蛋白質組學之后系統生物學的重要組成部分，它是英國Nicholson教授及其同事于1999年正式提出的［1］，代謝組學通過考察生物體由病理生理刺激或遺傳修飾引起的內源性代謝產物的變化，研究機體整體的生物學狀況，它把人體作為一個完整的系統進行研究，重點考察人體等生物系統的內源性代謝物及其網絡在疾病和毒物，藥物作用下的變化規律，目前，代謝組學也是毒理學研究中的一種重要技術手段和有利工具，是當前毒理學研究領域中最活躍的研究熱點［2］。本文主要就胚胎干細胞和代謝組學相關的實驗技術及基于胚胎干細胞的代謝組學在毒理學中的應用現狀進行了綜述，并對其中存在的問題及發展趨勢進行了初步探討。

1 胚胎干細胞在毒性評價中的應用

1.1胚胎干細胞在毒性評價中的意義胚胎干細胞是一種存在于早期胚胎中的具有全能性細胞，可分化成三個胚層的細胞。由于它具有全能性，具有對藥物作用反應迅速、敏感性高、干擾因素少等優點，根據胚胎干細胞特性而發展起來的胚胎干細胞試驗(embryonic stem test，EST)可以從細胞毒性，分化抑制以及分子生物學水平反映發育毒性，因此胚胎干細胞可以作為一種重要的體外藥物毒性評價工具［3］。

隨著工業生產的發展，人工合成化學物質的種類不斷增加，每年至少還有1000多種新的化學物質進入人類的生產和生活環境，對外源性化合物的危險性評價日益受到重視，目前急需能夠確切反映外源性化合物對人體毒性作用的安全性評價模型。hESC來源于人類，能夠真實反映人類細胞的生物特性，通過單一胚胎干細胞無限增殖和定向分化可以達到樣本的高度標準化，并且通過建立不同種族或地區的人類胚胎干細胞載體能反映種族或地區間的生物特征差異。因此，應用hESC進行毒理學研究可以獲得更直接的外源性化合物人體毒理學研究的資料［2］。

藥物研發不僅周期長，投入大，而且風險高，一個新藥從研發到上市大概需要歷時10～15年，耗資近10億美元。傳統的藥物安全性評價的方法是給予一定數量實驗動物大劑量待測化合物，觀察其毒性效應，然后將實驗結果外推到暴露于小劑量相同化學物的大量人群，這種方法不僅試驗周期長，而且從動物得到的數據很難外推到人。hESC作為一種體外毒性評價工具，具有快速、敏感、特異高、條件易控等優點，可以避免使用大批動物進行的長時間毒理研究，不僅可以節省動物及人力投入，還可縮短實驗周期，增加實驗的敏感性。于傳統方法相比，不用考慮對人體及動物的副作用，更無需大量懷孕動物，一旦建系就可以獲得源源不斷的細胞用于研究，同時對細胞毒性而言，胚胎干細胞對藥物等化合物的敏感性高于成體組織［4］。而且hESC作為良好的轉染載體，能表達多種報告基因，能夠滿足研發早期高通量篩選的需求。

1.2胚胎干細胞在毒性評價中的應用將hESC應用于毒理學研究既可克服傳統的體內和體外細胞毒性實驗的不足，又可避免種屬差異目前，hES已逐漸成為毒性篩選和毒理學機制研究必不可少的工具，其研究熱點主要集中于尋找特異的檢測終點和毒性效應標志物，進而建立和完善體外毒性評價模型。

1.2.1 發育毒物的體外篩選動物實驗未發現沙利度胺明顯的毒副作用，但1954年沙利度胺的上市，卻在歐洲誕生了大量肢體缺陷的新生兒，這不僅揭示了動物和人對藥物反映的差異，也揭示了藥物體內篩選的局限性。EST是檢測不同受試物對細胞增殖和分化的影響，通過受試物對hESC細胞的影響，對受試物影響個體發育的毒性和致畸能力進行判斷［5］，不需要受孕動物，同時根據實驗目的的需要，細胞分化為特定的組織細胞，通過對受試物的胚胎毒性進行高通量檢測［6］，已成為哺乳動物發育毒性體外評價的代替方法。歐洲替代方法驗證中心(the European Center for the Validation of Alternative Methods，ECVAM)曾在大約360種受試物中，選出有明確胚胎毒性的受試物30種，使用EST進行胚胎發育毒性檢測，結果表明，與在體實驗結論的符合率達到82%，其中強胚胎毒性的符合率更達到100%［7］。展示了EST成為受試物胚胎毒性初篩方法的良好基礎和應用前景。

1.2.2 靶器官毒性研究由于有些受試物胚胎毒性的產生，可能表現為較強的靶器官特異性，根據ESC的多能性，可以在不同的誘導條件下將其向特定組織器官的特定細胞分化，而且這種分化過程能反映受試物在整個細胞發育全過程的影響，利用這一特點可以對受試物可能作用的靶器官細胞及其方式和階段進行初步判別［3］。

Nieden等［8］結合當前分子研究技術，發展了分子水平的EST，將受試物作用于分化的ESC，提取發育過程中第9天的的細胞RNA，進行RT-PCR分析，然后進行TaqMan PCR實時分析，研究肌球蛋白重鏈基因(Myosin Heavy Chain，MHC)的定量表達，MHC的調節性表達可能作為一種新的快速反應胚胎毒性的檢測終點。

2 代謝組學在毒性評價中的應用

代謝組學是20世紀90年代后期發展起來的一門新興學科，它是繼基因組學，轉錄組學和蛋白質組學之后系統生物學的重要組成部分，它通過考察生物體由病理生理刺激和遺傳修飾引起的內源性代謝產物的變化，研究機體整體的生物學狀況。代謝組學在毒理評價中的應用主要是利用各種分析手段(高效液相色譜，High performance liquid chromatography ，HPLC、核磁共振，Nuclear Magnetic Resonance，NMR 和質譜，Mass Spectrum，MS等)定量檢測生物樣本(尿液，血漿，組織提取液等)中的內源性代謝產物，結合模式識別等化學技術對生物樣本進行系統的測定和分析，比較生物體在不同狀態下的代謝指紋圖譜的差異，然后將這些代謝信息與生物體的病理生理變化聯系起來，確定導致這些代謝改變的靶器官和作用位點，獲得相關的生物標志物。

2.1 毒性作用機制的研究藥物毒性作用機制是指機體接觸藥物開始至出現毒性損傷之間的一系列分子機制，例如毒物如何進入機體，如何與靶分子發生作用，如何產生其有害結果及機體的反應等，通過代謝圖譜可對藥物破壞正常細胞后引起的內源性代謝物的水平進行分析，從而研究其毒性作用機制，為準確評價藥物毒性提供理論依據［9］。

2.2 藥物臨床前毒性評價藥物臨床前安全性評價的目的之一就是確定藥物的毒性劑量范圍，并作為藥物的重要安全性能指標，與傳統方法相比，利用代謝組學技術確定藥物毒性劑量范圍的準確率更高，并為臨床合理用藥提供理論依據。

Chen等［10］利用液 -質聯用(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS)結合氣-質聯用(Gas Chromatography-Mass Spectrometry，GC-MS)的方法對雷公藤多糖成分在大鼠體內的毒性進行了研究，結果發現，當給藥劑量達到100 mg·kg-1時發現氨基酸及膽堿水平升高等情況，而且波動并不明顯，提示該藥可能具有較高的安全劑量，很大程度上提高了該藥的臨床應用。Schoonen等［11］利用代謝組學的方法研究了對乙酰氨基酚在大鼠體內的毒性，對多個劑量的代謝物水平波動情況進行檢測，至450 mg·kg-1時發現代謝物水平異常，由AST試劑盒證實該劑量下大鼠肝細胞出現壞死，故可將450 mg·kg-1定為藥物毒性劑量，從而為臨床安全用藥提供依據。

因此，代謝組學作為一種實驗操作和數據處理相結合的技術，能在靈敏度和特異性上滿足藥物臨床前安全性評價的要求，而且在時間和效益上滿足創新藥物研發的需求。

2.3 確定毒物作用靶器官及特異性生物標志物生物標志物是指反映生物體系與環境因子的相互作用，并能客觀測定和評價的某種特征性指標，可應用于疾病的診斷、防治和藥物毒性的評價等。利用代謝組學研究代謝指紋圖譜，可發現藥物引起的內源性代謝物的變化，找到與藥物毒 性相關的生物標志物，并作為藥物毒性篩選的依據。

Boudonck等［12］應用代謝組學尋找大鼠體內腎毒性的早期生物標志物。大鼠給予已知腎毒性藥物慶大霉素、順鉑和妥布霉素后，分別于1 d、5 d和28 d收集尿液和腎臟切片，通過氣-質聯用(GC-MS)和液質聯用(LC-MS)，發現單次給予藥物后，尿液中多胺類和氨基酸類含量升高，其時間要早于腎臟組織形態損傷和臨床上常規的腎毒性化學指標。長期給藥后，尿液中由腎毒性引起的氨基酸類物質的逐漸減少和腎臟組織中氨基酸類、核苷類物質的減少一致，而且和對照組比較，支鏈氨基酸水平和給藥時間成正比。Chan和Cai［13］采用LC-MS方法研究大鼠給予馬兜鈴酸后尿液的代謝圖譜，從中發現了犬尿烯酸和馬尿酸兩種可反映藥物毒性的生物標志物，可作為評價馬兜鈴酸毒性的生物學指標。

3 基于胚胎干細胞的代謝組學方法在毒理學中的應用進展

近年來，各國學者對藥物毒性評價方法做了比較系統和深入的研究，毒理學替代法研究在國外發展十分迅速，體外替代實驗的研究手段將細胞、組織培養與基因組學，蛋白組學和代謝組學有機地結合在一起，并增加了計算機模擬輔助評價系統。自2000年7月ECVAM正式批準胚胎干細胞試驗作為體外藥物和化合物毒性篩選動物試驗的替代方法，hESC在毒性評價中的應用受到廣泛的關注;加之代謝組學能把人體等生物系統作為一個完整的系統進行研究，著重考察這些生物系統的內源性代謝物及其網絡在疾病和毒性作用中的意義及藥物作用下內源性代謝物的變化規律，基于hESC的代謝組學研究在毒理學研究中日益受到關注。

盡管胚胎干細胞能模擬胚胎的早期發育，被用多種人類疾病的體外模型，但有關胚胎干細胞產生的小分子物質的動態變化研究較少，在病理或化學藥物作用下，小分子代謝物如糖，有機酸，氨基酸和脂肪酸參與了細胞應答的功能機制，這些小分子代謝物可以作為疾病和毒性反應的候選生物標志物。代謝組學利用核磁共振(NMR)或者質譜技術可以對小分子代謝產物進行準確的檢測。利用胚胎干細胞和代謝組學技術的結合來評價發育毒性是由威斯康辛大學的Cezar等［14］首次提出，并進行了較深的研究，采用一種已知的神經發育毒性藥物丙戊酸鹽作用于胚胎干細胞和胚胎干細胞來源的神經前體細胞，收集細胞上清液進行LC-MS檢測及分析，結果表明，色氨酸代謝的中間產物犬尿素(3-氨茴酰丙氨酸)和谷氨酸代謝產生的小分子代謝產物的含量有顯著的升高，并通過RT-PCR進行了驗證，提出犬尿素(3-氨茴酰丙氨酸)及其代謝產物可以作為癲癇藥物發育毒性的候選生物標志物，胚胎干細胞蛻變中間產物可能作為預知和檢測藥物療效和毒性反應的生物標志物。

Paul等［15］利用胚胎干細胞和代謝組學相結合的方法來預測藥物的發育毒性。采用LC-MS的分析方法來檢測幾種有明確致畸性藥物刺激ESC后產生的小分子物質含量的變化，這些小分子可以作為發育毒性的生物標志物，能更加敏感的預測藥物的致畸性。除此之外，這種模型在后來的對維生素A和碘胺酮等八種藥物進行盲法試驗中，能準確預測到七種藥物是否有致畸性。所以利用ESC和代謝組學的方法去尋找發育毒性的生物標志物，這可以作為一種體外評價發育毒性的新思路。

4 展望

近年來，國內外有關中草藥不良反應的報道日見增多，在一定程度制約了中醫藥事業的現代化和國際化進程，但目前尚無中藥毒性作用評價的統一標準及客觀依據。如何制定一套快速、準確、客觀、敏感的中藥安全性評價體系是當前中藥安全性評價亟待解決的問題之一。

將代謝組學研究方法應用于胚胎干細胞進行毒理評價，考察藥物在接近常態狀況下對胚胎干細胞影響的生物學過程，考察毒性藥物作用前后胚胎干細胞的代謝物圖譜變化，通過與毒性靶器官細胞和整體動物實驗代謝組學毒性標志物進行對比分析，確定其關聯性，找出基于胚胎干細胞代謝組學毒性標志物，發現一個或一組毒性作用的分子標記物，并初步確定該(組)毒性標志物的毒效范圍，進而應用于毒理作用評價，為今后中藥毒性評價提供快速、敏感、可靠的毒性標志物。從而為中藥安全性評價開辟一條全新的研究思路，并建立一套快速、敏感、高效的評價方法。

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