沙門菌載體重組疫苗的研究進展

馬延濱,高閃電,叢國正,?；菔|

(中國農業科學院蘭州獸醫研究所國家口蹄疫參考實驗室家畜疫病病原生物學國家重點實驗室農業部畜病毒學重點開放實驗室,甘肅蘭州 730046)

目前,大多數疫苗都采用皮下或肌肉注射,可以誘導有效的血清免疫,但通常無法誘導黏膜抗體(sIgA)的產生。皮下或肌肉注射導致動物產生較大的應激反應,采食量下降,影響動物生長繁殖。實際生產中的不規范免疫操作可能導致病原微生物在個體間的人為傳播而引發疾病。

細菌和病毒在自然宿主體內的傳播,導致多種感染性疾病持續存在。這種情況甚至危及到公共安全以及瀕危動物的生存[1]。在大多數情況下,通過屠宰的手段控制病原菌在自然宿主之間的傳播是不經濟的,同時也不會被公眾所接受。

針對皮下或肌肉注射的特點,以及野生動物免疫現狀。口服疫苗的研制成為當前熱點。

口服疫苗是指通過口服,誘導機體產生針對致病原的特異性抗體或細胞免疫,從而使機體獲得保護或消滅該病原能力的生物制品。

目前,口服疫苗的研制主要是通過轉基因技術將目的抗原基因克隆表達到載體質粒上,然后將其轉染到特定的載體系統中表達。一般常用的活載體系統包括細菌載體、病毒載體、植物載體。這里我們將介紹弱毒沙門菌作為載體制備口服疫苗的研究進展。

1 沙門菌載體疫苗的免疫機制

1.1 重組沙門菌穿越腸壁的機制 腸上皮層覆蓋有皮爾氏小體(Peyer′s patches,PP),PP表面有特化的上皮M細胞(membranous epithelial cells)[2]。重組沙門菌可以粘附在M細胞上,然后M細胞將沙門菌載體轉移到皮爾氏小體中,完成載體疫苗的穿越腸壁過程[3]。

1.2 沙門菌載體疫苗的免疫過程 PP的M細胞下是皮下半球形區域。這個區域有豐富的DCs(樹突狀細胞),位于半球形區之下的是B細胞囊,它的兩邊被T細胞填充。當重組沙門菌進入PP時,首先被半球形區中的 DCs所捕獲,然后將其呈遞給T細胞,誘導PP中的T細胞產生免疫應答或者直接將其呈遞到MLN中誘導產生體液免疫[4]。

在重組沙門菌登革熱疫苗株SL3261/pLT105的免疫研究中發現,重組疫苗分泌的可溶性目的抗原不能保護小鼠免受登革熱病毒感染。弱毒沙門菌膜上表達的抗原決定簇與單純的分泌型抗原相比,菌膜上表達的抗原決定簇可以誘導更強的免疫應答[5]。

2 弱毒沙門菌的研究

沙門菌致弱的根本是使之不能合成芳香族化合物的前體,在哺乳動物沙門菌致弱時,應用最多的是誘導細菌苯甲酸對位氨基的缺失。這些突變株即使對免疫缺陷型小鼠也不會致病。但是對不同類型的沙門菌來說,他們的生長速度基本相同[6]。

T3SS(type three secretion system)對沙門菌進入PP來說是必需的[7]。與沙門菌的侵襲和細胞內生存相關的功能被位于毒力島的至少60種相關基因所調節,其中主要是對沙門菌T3SSⅠ(type three secretion systemⅠ)和T3SSⅡ(type three secretion systemⅡ)的編碼調節。T3SSⅠ存在于基本上所有的沙門菌亞種,并且是非侵襲性沙門菌感染所必需的。T3SSⅡ存在于胞內寄生以及致病沙門菌。

S Typhi(Ty2 aroC-ssaV-)M01ZH09中存在一個無效突變。突變前這個基因編碼T3SSⅡ中的成分,并且是參與合成細菌生長必需的一種芳香性物質[8]。這種突變型菌株作為口服疫苗已經在一個大的隨機人群中進行了試驗。試驗表明,這種口服傷寒疫苗不會引發機體的病理表現,并且提供比目前所用傷寒疫苗更強的保護力。因此,S Typhi(Ty2 aroC-ssaV-)M01ZH 09可以作為一種理想的口服疫苗載體。

3 沙門菌載體重組疫苗的實驗室研究

目前,越來越多的弱毒沙門菌作為疫苗載體成為實驗室的研究對象,并且取得了較好的成果。3.1 沙門菌載體重組疫苗在細菌中的應用 Leslie W JBaillie,Marcela F Pasetti等用沙門菌突變株Typhi Ty21a組建了炭疽的重組載體疫苗?？诜庖咝∈蠛?少數出現對致死性炭疽孢子較強的特異性應答,免疫效果優于目前鋁包被炭疽疫苗(AVA)[9];Qianli Ma,Qiao Zhang等構建的表達psaA(肺炎球菌表面粘附素A)和pspA′(肺炎球菌N-端蛋白A)的重組沙門菌疫苗可以誘導表達高水平的鼻黏膜sIgA以及血清IgG[10]。

A line F O liveira,Roque-Barreira等構建了R.equi(馬紅球菌)VapA抗原的重組沙門菌疫苗株。R.equi感染小鼠時發現,與非免疫小鼠相比:口服免疫小鼠呈現出了3～7倍的病原清除能力;感染后10 d,血液中病原菌數低50倍;急性感染期以及壞疽期,肝的肉芽腫降低 2倍,血清中 anti-VapA IgG2a的水平明顯升高[11]。

Kulkarni R R,Parreira V R等用制備的表達產氣梭菌 FBA(fructose-biphosphate-aldolase)和HP(hypothetical protein)的重組沙門菌疫苗免疫肉雞后,可以明顯的降低肉雞壞疽性腸炎的發生,使雞獲得抵抗梭菌的能力[12];Simon MCutting,Jen-Min Huang等用構建的沙門菌載體結核疫苗免疫小鼠時,產生了強烈的MPT64抗原的細胞免疫應答,對結核菌的感染有較強的保護作用[13]。

3.2 沙門菌載體重組疫苗在病毒中的應用 Ai-Li Shiau,Chao-Liang Wu等克隆了豬的ProT cDNA(前胸腺素反轉錄基因),并且用低毒的S choleraesuis攜帶 ProT的重組質粒。結果顯示,重組S.choleraesuis在小鼠中可以表達ProT,誘導機體的免疫應答[14]。

Jian-Fang Ning,Xiao-Lin Meng等使用沙門菌株SV 4089作為小龍蝦白點綜合征病毒(WSSV)DNA疫苗質粒的細菌載體,免疫結果顯示疫苗得到了較好的呈遞和釋放[15]。試驗說明減毒沙門菌可以作為疫苗載體應用到節肢動物中。

Aaron PWhitem,Shu-Lin Liu等以沙門菌為載體的hepatitis B virus x gene(HBX)疫苗免疫小鼠,出現了明顯的CTL效應以及IFN-γ分泌型T細胞的增多。用表達有HBX的黑色素瘤細胞攻擊小鼠時發現,免疫小鼠黑色素瘤的增長速度、大小以及重量與未免疫小鼠有明顯的差異[16]。

4 存在的問題及展望

與其他弱毒菌株一樣,弱毒沙門菌作為載體有毒力返強的問題,并且可能存在著微弱的致病性,在實際應用中受到一定的限制。作為載體使用的弱毒沙門菌菌株較少,在一定程度上限制了沙門菌載體重組疫苗的研究與發展。

分子生物學技術的發展,以及對沙門菌毒力的深入研究,將會促進弱毒沙門菌的研究進程,更多的穩定沙門菌弱毒株將會應用到載體疫苗的研制中。沙門菌載體疫苗的臨床應用,將會簡化免疫程序,節省大量的人力、物力。為野生動物的免疫保護提供一種新的思路。

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