補氣類中藥抗神經細胞缺血/缺氧性凋亡作用的研究進展

姚于飛， 高幼奇， 胡國柱

(1.南昌大學醫學院，江西南昌， 330006;2.江西省人民醫院神經內科，江西 南昌 330006)

腦中風引起中樞神經系統損傷都具有神經細胞缺血/缺氧的病理發展過程，其神經細胞死亡許多屬于細胞凋亡。故細胞凋亡調節的干預具有極大的治療潛力，其將可能成為腦中風以及血管性老年癡呆的預防和治療的新途徑。因此本文就細胞凋亡與腦缺血/缺氧的關系及機制，以及補氣類中藥對凋亡影響的研究現狀進行綜述。

1 細胞凋亡的生物學特征

凋亡細胞不但存在形態改變［1］，而且具有細胞生化及基因表達變化。細胞凋亡主要有三條途徑:①外源性途徑:Fas/FasL、TNFRI/TNF－α、DR3/Apo3L、DR4/Apo2L 及 DR5/Apo2L等配體與受體結合后激活caspases家族蛋白并引發級聯反應，誘導細胞凋亡［2－5］。②內源性途徑:生長因子、激素、細胞因子缺乏，以及自由基、缺氧、照射、病毒感染等非受體介導的凋亡刺激，其引起BH3－only蛋白家族(BAD、BIK、BID、HRK、BIM、BMF、NOXA、PUMA)活化，導致線粒體外膜通透性轉換孔開放、膜電位下降，促使cyt c、DIABLO、絲氨酸蛋白酶 Omi、凋亡誘導因子(apoptosis－inducing factor，AIF)、內切酶G、caspase活化的 DNA酶(caspase activated DNAse，CAD)等釋放，最終誘導細胞凋亡［6－7］。③穿孔素－顆粒酶 B途徑:顆粒酶B進入細胞后直接裂解天門冬氨酸殘基活化caspases 蛋白［8－10］。

2 補氣類中藥對缺血/缺氧后神經細胞凋亡的影響

早在1993年Linnik M.D等人［11］結扎大鼠右頸總動脈并栓塞右大腦中動脈造成大腦局部缺血24 h后，從缺血區域大腦皮層細胞提取的DNA經凝膠電泳后顯示出凋亡特征性梯狀條帶。急性缺氧和慢性間斷缺氧大鼠模型證明缺氧可誘導遲發性神經細胞凋亡［12－13］。大鼠大腦皮層神經元經缺氧復氧培養也證明缺血/缺氧能誘發神經細胞凋亡［14－17］。腦缺血和出血均有缺血/缺氧的病理過程，而腦中風的療效中西醫結合均較單純西醫好，中醫藥對腦中風的治療補氣中藥不可缺少。

2.1 抗氧自由基損傷

腦缺血/缺氧條件下中樞神經系統產生大量的自由基，導致神經細胞凋亡［18］。D－半乳糖造模的衰老小鼠給予大棗水煎劑灌胃6周后腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著提高，丙二醛(MDA)顯著下降［19］。腹腔注射山藥多糖40 d后腦B型單胺氧化酶(MAO－B)活性顯著下降，GSH－PX活性、SOD 活性、腦 Na+/K+－ATP 酶活性顯著提高［20］。人參總皂苷、白術多糖、黃精多糖、甘草酸二銨(DG)或甘草總黃酮治療大腦中動脈栓塞(MCAO)模型大鼠，其腦組織中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、一氧化氮(NO)、MDA含量降低，SOD活性升高，腦組織病理損傷減輕，細胞凋亡減少［21－26］。

2.2 抑制細胞內Ca2+的超載

連二亞硫酸鈉無糖培養基培養胚鼠大腦皮質神經細胞模擬缺氧/缺糖證明，黨參皂苷L1顯著降低神經細胞的凋亡率，細胞內Ca2+平均熒光值與模型組(47.37±9.68)比較，0.1～0.01 mg/L黨參皂苷L1(27.34±8.57～36.55±14.23)能顯著降低細胞內Ca2+［27］。采用激光共聚焦掃描檢測缺氧培養的胚大鼠海馬神經元內游離鈣發現，缺氧組熒光增強度為(73.5±10.31)%，缺氧 +無鈣組為(4.5±2.58)%，缺氧+不同濃度人參皂甙Rb1(GSRb1)組(20、40、60、80 μmol/L)分別為(20.2 ±3.41)%、(13.6 ±2.98)%、(10.5±3.62)%和(12.7±4.51)%(均P＜0.01)，證明缺血缺氧時神經細胞內游離鈣的上升主要是來自細胞外鈣離子內流，GSRb1可通過抑制細胞外鈣離子內流減輕細胞內的鈣超載，保護缺血神經元［28］。人參二醇皂苷(PDS)(1.5 g/L)抑制缺氧大鼠大腦皮層神經元缺氧1 h時的L－型鈣通道活性，L－型鈣通道的開放時間由缺氧前(9.1±1.0)ms降低至缺氧后(2.1±0.4)ms(P＜0.01)，開放概率由缺氧前的(0.165±0.025)減少至缺氧后的(0.021±0.009)(P＜0.01)，證明PDS可抑制缺氧誘導的鈣通道的開放并減少鈣離子的內流［29］。黃芪多糖以1.0 g/kg于MCAO模型制作前30 min和制作后8 h分兩次腹腔注射，大鼠缺血1 h再灌注24 h后腦組織中Ca2+、谷氨酸、天門冬氨酸等含量顯著低于單純模型組(P＜0.05～P＜0.01)［30］。三七總皂苷降低缺氧/缺糖培養的大鼠海馬神經細胞內的鈣離子濃度，抑制神經細胞凋亡［31］。

2.3 對凋亡相關基因表達的調控

人參皂苷Rg125～100 mg/kg灌胃7 d后制備MCAO模型缺血2 h再灌注22 h發現，人參皂苷Rg1(50～100 mg/kg)顯著地減少缺血側腦組織 Caspase－3 和增加 Bcl－2表達［32］。而腹腔注射10～40 mg/kg給MCAO模型大鼠，2 h～24 h后腦組織 Bcl－2 增高，Bax 降低，Bcl－2/Bax 比值顯著上調;缺血大鼠海馬CA1區Fas陽性細胞數(15.20±3.16～9.20±3.49)顯著低于單純模型組(26.00±5.64)，Fas－L表達陽性細胞數(13.40±3.03～8.20±3.01)也低于單純模型組(21.20±4.71)，Caspase－3 表達陽性細胞(12.30 ±2.91、7.30±3.56)均低于單純模型組(17.40±3.20)，腦組織cjun N－末端激酶(pJNK)的陽性表達率(23.89±6.77)～(9.15 ±4.77)低于單純模型組(27.15 ± 8.46)［33－35］。即使在MCAO模型大鼠缺血再灌注后腹腔注射人參皂苷Rb1(40 mg/kg)，也可見再灌注12 h～10 d內神經元凋亡抑制蛋白(NAIP)陽性細胞數顯著高于缺血組，Bcl－2陽性細胞數上升，Bax陽性細胞下降［36］。大鼠全腦缺血模型制備前3 d給人參皂苷Rb130 mg/kg并持續至缺血后3d，結果發現與單純缺血組比較CA1、DG及皮層神經元內的bcl－2表達顯著增加，而bax表達顯著減少［37］。體外新生大鼠大腦皮層神經細胞缺氧培養也證明人參皂苷Rb1在50～100 mg/L的濃度范圍內通過增加缺氧神經細胞Bcl－2，減少Bax的表達，提高Bcl－2/Bax比值達到抑制神經細胞缺氧性凋亡的作用［15］。

大鼠口服西洋參莖葉皂苷7 d后制作成MCAO模型，結果西洋參莖葉皂苷(50、100 mg/kg)各組TUNEL陽性細胞顯著少于缺血模型組，caspase－3 mRNA表達及 caspase－3陽性細胞數均顯著低于缺血模型組［38］。

腹腔注射黃芪注射液4.5 g/kg 30 min后制作MCAO模型缺血2 h再灌注6 h后發現，與模型組相比腦組織Bax陽性細胞減少，而 Bc1－2陽性細胞增加(P＜0.05)［39］。大鼠MCAO模型制作前12 h和30 min腹腔給予黃芪注射液，腦缺血3 h后每12 h注射一次，結果再灌注12 h、24 h、48 h后各時間點caspase－8陽性細胞顯著低于模型組［40］。黃芪煎劑(6 g/kg/d)灌胃1次，共7 d，然后制作大鼠MCAO模型，腦缺血2 h再灌注6 h后腦組織Fas－L陽性細胞較模型組顯著降低［41］。大鼠MCAO模型缺血2 h再灌注24 h前1 h腹腔注射黃芪注射液200 mg/kg，再灌注24 h后黃芪組大鼠缺血側皮層c－fos陽性細胞顯著少于模型組［42］。缺氧缺糖0.5 h復氧復糖培養原代大鼠海馬神經細胞0～120 h，黃芪注射液(0.5 g/L生藥)于缺氧缺糖時加入，其各個時間點c－Jun氨基末端激酶3(JNK3)在mRNA、蛋白水平，以及JNK3活性水平上均顯著低于單純缺氧缺糖組，并抑制了神經元凋亡［43］。黃芪注射液(黃芪10、50、100 g/L 組)能顯著降低缺氧培養誘導的神經細胞凋亡率，增加了缺氧的神經細胞Bcl－2 的表達，減少了 Bax 的表達，提高了 Bcl－2/Bax 比值［14，44］。

MCAO制作前10 min舌下靜脈給予甘草酸二銨(DG)注射液20 mg/kg，缺血2 h再灌注24 h后梗死側腦組織中，DG組Bcl－2表達顯著高于缺血組［23］。DG對大鼠脊髓缺血再灌注損傷后NF－κB p65和Caspase－3的表達明顯低于對照組，TUNEL 及檢測也證明抑制了神經元凋亡［45，46］。

3 展望

盡管缺血后不同基因的變化對細胞凋亡的調控及影響的確切機制尚不清楚，但理解細胞凋亡在缺血性神經細胞死亡中的作用具有重要的臨床意義。抗細胞凋亡將可能成為腦中風神經細胞損傷的治療有效手段。根據中醫理論，同一藥性中藥功效相同或相近。事實上人參、黃芪、黨參［27］、黃精、甘草、西洋參、太子參［47－48］、白術［49］、大棗［50］、山藥［51］等補氣類中藥都具有抗多種原因引起的細胞凋亡作用。根據現有補氣類中藥抗神經細胞凋亡研究結果，我們有理由推測所有補氣中藥均有抗神經細胞缺血缺氧性凋亡的作用。

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