中藥有效成分半抗原抗體制備技術的研究進展

廖國平， 汪 艷， 陳莉婧， 張忠義

(南方醫科大學珠江醫院藥劑科，廣東廣州 510282)

隨著免疫分析技術的不斷發展，人們對一些微量的小分子活性物質進行痕量分析，利用它們具備反應原性的特點制備特異性抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)，采用免疫學分析手段進行檢測。這些免疫分析方法憑借其特異性強、靈敏度高、檢測迅速、樣本通量大、成本低廉的特點，在食物過敏、農藥殘留分析、抗生素殘留分析、中藥有效成分研究等領域有著廣泛的應用。抗體作為各種免疫分析的核心試劑，對免疫分析方法的靈敏度、特異性等起著至關重要的作用。因此，高親和力抗體的制備是免疫分析技術發展的關鍵。

大多數中藥有效成分是小分子物質，如有機酸類、黃酮類、木脂素類、皂苷類和萜類等，其中一部分只有反應原性而不具有免疫原性，屬于半抗原。由于分子量太小，半抗原結構中含有較少的抗原表位，不能刺激機體產生抗體，故必須和特定的高分子量的蛋白類或多肽結合，形成半抗原-載體復合物(完全抗原)，經動物免疫程序才能制備針對半抗原的特異性抗體。

近年來，國內外科研人員在中藥有效成分半抗原的抗體制備這一領域做了大量的探索和研究，并開始將中藥有效成分半抗原抗體應用到中藥現代化領域。本文主要對近年來中藥有效成分半抗原的抗體制備過程中的研究情況作一綜述。

1 中藥半抗原的結構特點

中藥有效成分半抗原大多是小分子碳水化合物，其分子結構復雜，作者將其大致分為有機酸類、黃酮類、木脂素類、皂苷類、萜類等幾類進行分析:

1.1 有機酸類 有機酸類(不包括氨基酸)是分子結構中含有羧基的一類化合物，而羧基易與載體上的氨基偶聯形成完全抗原。有人利用綠原酸［1］、阿魏酸［2］等有機酸結構中的羧基與載體偶聯制備了完全抗原。

1.2 黃酮類 黃酮類是一類具有三環苯基苯并吡喃結構的呈色化合物，其母核上常有羥基、甲氧基等取代基，而羥基的酸性較強，可以先形成混合酸酐再與載體上的氨基偶聯形成完全抗原。法國波爾多大學Bennetau B等人利用混合酸酐法將橙皮苷［3］、芒丙花黃素、黃豆苷元和染料木黃酮［4］等黃酮類半抗原在三丁胺的存在下與氯甲酸異丁酯反應形成混合酸酐，再與BSA上的伯胺基偶聯形成完全抗原，最終免疫新西蘭兔制備了一系列多克隆抗體。

1.3 木脂素類 木脂素類多數是由二分子C6-C3單體縮合而成的化合物，而組成木脂素的C6-C3單體主要是對羥基桂皮醇、松柏醇和芥子醇等，因而在木脂素的苯核4位上有羥基存在，可以與氮化修飾的載體偶聯制備完全抗原。日本名古屋大學Nagasaki T等人利用重氮化法將Agatharesinol［5］與重氮化修飾的BSA偶聯形成偶聯比高達27的完全抗原。

1.4 皂苷類 皂苷類多數由多分子糖或糖醛酸與苷元組成，而糖基可以被高碘酸鈉法氧化成雙醛、糖醛酸中含有羧基，因而適合與載體偶聯制備完全抗原。日本福岡大學Shoyama Y等人利用高碘酸鈉法將柴胡皂苷類［6］、甘草皂苷［7］、人參皂苷 Re［8］等皂苷類半抗原與載體偶聯制備完全抗原，然后利用聚乙二醇法(PEG)制備了一系列單克隆抗體。

1.5 萜類 萜類是概括所有異戊二烯的聚合物以及它們衍生物的總稱，而衍生物大多以醇、醛、酮、羧酸、酯類以及苷類等多種形式存在，因而易與載體偶聯制備完全抗原。有人成功制備了紫杉醇［9］、檸檬苦素［10］等萜類的完全抗原。

2 載體和佐劑的使用

中藥有效成分半抗原無免疫原性，通常需要與大分子載體偶聯制備完全抗原才能誘生抗體。完全抗原在機體的免疫應答過程中，載體部分可誘使免疫系統產生新的T細胞表位(epitope)，半抗原部分可誘使免疫系統產生新的B細胞表位，因而完全抗原能夠被抗原遞呈細胞(APC)識別與捕獲，與組織性復合物分子(MHC)結合形成復合物，進而將T細胞表位遞呈給相應的T細胞克隆并使之活化，在活化的T細胞輔助下，結合了新B細胞表位的B細胞對完全抗原進行克隆活化、分裂、增殖，并分泌針對新B細胞表位的抗體［11］。自從1945年Landsteinen首次將小分子半抗原偶聯到載體上誘生出抗體以來，至今利用這種技術已制備了上百種小分子的抗體。

制備完全抗原需要有合適的載體，而理想的載體分子應該具有:(1)強免疫原性;(2)大量可與半抗原結合的功能性基團;(3)較好的溶解度(即使衍生化后仍然能保持較好的溶解度);(4)體內無毒性［12］。由于蛋白質結構中含有大量功能性基團，免疫原性好，不僅可以增加半抗原的分子量，還能對半抗原產生載體效應，故現在一般選用各種蛋白質作為大分子載體。常見的蛋白質載體有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清蛋白(OVA)、匙孔血藍蛋白(KLH)、兔血清白蛋白(RSA)、人血清白蛋白(HSA)、甲狀腺球蛋白(thyroglobulin)、肌紅蛋白(myoglobin)等。目前，用得最多的是牛血清白蛋白(BSA)，因為其理化性質穩定、不易變性、價廉易得，而且賴氨酸含量高，自由氨基多，在不同的pH和離子強度下均有較好的溶解度，在含有機溶劑(如DMF)的情況下仍可和半抗原進行偶聯，且在偶聯后仍保持可溶狀態［4］。

近年來，陽離子化牛血清白蛋白(cBSA)開始進入科研工作者的視野，cBSA是通過化學反應用帶正電荷的氨基取代BSA中的帶負電荷的羧基而成，與細胞膜上帶負電荷的抗原提呈細胞(APC)有極好的親和性，因而能加快機體免疫應答速度，增加免疫應答的程度并在體內持續較長的時間，產生高效價的抗體［13］。有文獻報道，由于cBSA表面高陽離子化(pI＞11)，相同劑量下的cBSA誘導T細胞增殖的程度明顯高于 BSA［14］。

由于完全抗原的量通常極少，免疫動物過程中必須使用佐劑。采用佐劑可以起到緩釋免疫抗原的作用以增加對動物的局部刺激，同時還能增強局部淋巴結的炎癥反應［15］。理想的佐劑應該能夠激發多種實驗動物維持較高的抗體滴度，并可用于絕大多數抗原，易制備，便于注射，免疫毒性低且對研究者無危害。遺憾的是目前尚無完全符合上述標準的佐劑，可用于抗體制備的各類佐劑主要包括油乳劑、礦物鹽類、皂苷類、微生物產品、人工合成品以及混合產物的佐劑。油包水型乳劑，如弗氏完全佐劑(FCA)和弗氏不完全佐劑(FIA)，在抗體制備領域應用最廣泛、易得、刺激性小、產生較少的炎性產物，但是仍可能引起實驗動物的大量副作用［16］。鋁佐劑以氫氧化鋁、硫酸鋁或磷酸鋁水合凝膠的形式從抗原溶液中強烈吸附抗原，形成沉淀，當其注射到機體內后形成一個“抗原庫”，緩慢釋放出抗原，充分延長了抗原的作用時間;同時還能顯著地降低抗原用量和加強免疫應答;最引人注意的是，在進行首免后，再免時可以不用佐劑［17］。眾所周知，鋁佐劑可能在注射部位形成瘙癢結節，包括無菌性膿腫、紅斑、皮下結節、肉芽腫炎癥和接觸性超敏反應，而納米鋁技術已為解決該問題提供了可能性［18］。

3 半抗原與載體的偶聯

在制備完全抗原時，半抗原是通過一個“橋”(偶聯劑)與載體偶聯。橋結構可以防止大分子載體對半抗原的屏蔽作用，即防止半抗原與載體結合時被包埋在卷曲凹陷的蛋白質結構中，從而更易被B細胞識別。4-6個碳原子的間隔對于抗原抗體反應已足夠，研究表明半琥珀酸鹽(4個碳原子的橋)可產生最大的免疫反應［19］。Maiken 等［12］對 7.2NY(肽鏈半抗原)的抗體研究發現，偶聯比、偶聯位點對產生的特異性抗體的親和力、滴度有很大影響。

理想的偶聯方法應該能:(1)與半抗原以特定的化學結構100%偶聯，產物的組成均一;(2)產生穩定的偶聯，重復性好;(3)偶聯的操作簡單，不影響生物活性;(4)經濟易得。但是目前為止沒有一種偶聯方法能夠完全滿足上述要求，并且不同方法的偶聯效率有較大差距。目前常見的偶聯方法主要有以下幾種:

3.1 碳二亞胺法 碳二亞胺(EDC)使羧基與氨基間脫水形成酰胺鍵，半抗原上的羧基先與EDC反應生成一個中間物，然后再與載體上的氨基偶聯形成完全抗原。白花丹素［20］、柚皮苷［21］等均可在水溶性碳二亞胺的作用下溶解，與蛋白載體偶聯制備完全抗原。

3.2 半琥珀酸鹽法 某些帶有羥基的半抗原可與琥珀酸酐反應形成帶羧基的化合物，再與載體上的氨基偶聯形成完全抗原。莪術醇［22］完全抗原即用莪術醇先與琥珀酸酐反應形成莪術醇丁二酸單酯，再與BSA偶聯制備而得。雷公藤內酯醇［23］完全抗原即在弱堿性環境下，用琥珀酸酐對雷公藤內酯的14位羥基進行衍生化修飾形成帶羧基的莪術醇丁二酸單酯，再以碳二亞胺做偶聯劑與cBSA偶聯制備而得。

3.3 高碘酸鈉法 某些帶糖基的半抗原可以通過高碘酸鈉的氧化作用形成帶雙醛基的化合物，再與載體表面的氨基偶聯形成含Schiff堿的共價結構的完全抗原。番瀉苷［24］、馬兜鈴酸 II［25］、紫杉醇［26］等均是在高碘酸鈉氧化后再與 BSA 偶聯制備完全抗原。芍藥苷［27］的完全抗原即在高碘酸鈉氧化后與HSA偶聯制備而成。但此偶聯方法易破壞半抗原中的某些親水基團，并使該基團在完全抗原中表現為疏水基團，疏水基團因為疏水相互作用性被載體蛋白包裹至內部而不能直接和B細胞的表面接觸，最終不能刺激B細胞產生相應的抗體［28-29］。

3.4 混合酸酐法 含有羧基或酚羥基的半抗原可以在三級胺存在下與氯甲酸異丁酯反應，生產活性中間體混合酸酐，再與蛋白載體上的伯胺基反應，形成酰胺交聯鍵。橙皮苷［3］、芒丙花黃素、黃豆苷元和染料木黃酮［4］的完全抗原即在三丁胺的存在下與氯甲酸異丁酯反應形成混合酸酐，再與BSA上的伯胺基偶聯而成。

3.5 重氮化法 含有芳香胺的半抗原也可通過與亞硝酸反應形成重氮鹽，再與蛋白質的酪氨酸殘基上的酚羥基、組氨酸殘基上的咪唑環或色氨酸殘基的吲哚環反應。該偶聯方法可以通過重氮化后顏色的變化(紅棕色)判斷是否偶聯成功。但該方法重氮化連接鍵不穩定、副反應嚴重，可能引起蛋白大量的沉淀，需特別注意。Nagasaki［5］等人將該方法靈活應用到去甲木脂素的完全抗原制備，首先將對氨基馬尿酸(pAHA)取代BSA上的賴氨酸殘基形成芳香胺基團，修飾后的BSA再經過重氮化后與agatharesinol上的活性氫偶聯形成完全抗原。

3.6 曼尼希法 對于不含常見功能性基團的而含活性氫的半抗原通常選用重氮化法和曼尼希法，曼尼希法利用cBSA載體與甲醛脫水交聯，然后再與半抗原上的活性氫偶聯形成完全抗原;而且曼尼希法則可以形成穩定的共價結構、副反應較少、偶聯效率高、適用面廣，有較大的應用前景，但該方法禁用于含胺基的半抗原的完全抗原制備，以防半抗原自身聚合對反應產生干擾［13］。

上述這些偶聯方法同樣適用于抗體導向藥物的研究，所不同之處在于半抗原連接的蛋白是免疫球蛋白，含有大量的氨基、羧基等功能性基團，同時偶聯應盡量避開抗原結合區防止抗體活性受影響。

4 完全抗原的純化及鑒定

半抗原與載體偶聯后所得的完全抗原必須進行純化以除去未反應的半抗原、交聯劑、鹽類及其它小分子雜質。完全抗原的純化對其自身的鑒定及產生高質量的抗體都是十分重要的。目前最常用的純化方法是透析和排阻層析脫鹽。透析所需時間一般較長(通常需3 d以上)，但純化較為徹底、操作相對簡單。將偶聯后的反應體系裝入適宜孔徑的透析袋中，然后放入透析液(常用PBS緩沖液、碳酸鹽緩沖液、生理鹽水、去離子水等)中即可，定時更換透析液，以透析外液中檢測不出小分子為止。排阻層析常用的介質有葡聚糖凝膠、纖維素及聚丙烯酰胺凝膠等，脫鹽所需時間較短(通常僅需10 min以內)，通常分子量較大的完全抗原較早流出，易與分子量小的物質分離，但操作相對復雜，需要對流出組分進行跟蹤分析，進一步確定目標組分。

經純化后的完全抗原必須經過鑒定，才能初步判斷半抗原與載體是否偶聯成功以及定量分析其偶聯比。目前完全抗原鑒定的常見方法主要有以下幾種:

4.1 紫外掃描法 在紫外區有吸收的半抗原，首先可以將偶聯物紫外光譜的最大吸收波長與原載體和半抗原進行比較，判斷是否偶聯成功［30］，然后根據吸收度的加和性原理，分別測定半抗原、載體、偶聯物在吸收峰處吸收度，計算其摩爾吸光系數(e)根據公式:偶聯比 =(e偶聯物－ e載體)/e半抗原計算。該方法應用范圍廣、分析成本低、操作簡單、快速，但是對于無紫外吸收的半抗原難以進行鑒別。

4.2 紅外光譜法 將偶聯物、載體、半抗原等與KBr壓片后進行紅外檢測，通過分析各紅外光譜圖中各特征波數區域吸收峰變化，初步判定偶聯是否成功［31］。該方法應用范圍廣、特征性強、提供信息多，因而能夠初步解釋偶聯反應機理，但定量分析時誤差大，靈敏度低，故很少用于定量分析。

4.3 基質輔助激光解吸附質譜法 以芥子酸為介質，通過飛行質譜測量供試品分子量，由于偶聯物的分子量與載體的分子量不同，在飛行質譜中的飛行速度有所不同，根據完全抗原的質荷比(m/z)與載體的質荷比(m/z)，可以計算得出完全抗原中半抗原與載體的結合摩爾比［32］，該方法最大優點為供試品用量少，靈敏度高，結果直觀，但對儀器要求較高。

4.4 其他方法 上述幾種方法已可滿足絕大多數半抗原的完全抗原鑒別，近年來也有人使用凝膠-高效液相色譜法［21］、核磁共振法［33］、圓二色光譜法［34］、原子力顯微觀察法［35］、熒光光譜法［36］等新方法對完全抗原進行鑒別。

5 中藥有效成分半抗原抗體在中藥領域的應用

目前國內外研究者大多利用中藥有效成分半抗原偶聯制備完全抗原，然后用其對小鼠進行免疫，再使免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，用培養基篩選出融合成功的雜交瘤細胞，再將該細胞進行體外擴大培養，接種于小鼠腹腔，再從其腹水中分離出高效價的單克隆抗體(Mab)。MAb可用于建立新的免疫分析方法對中藥原藥材進行檢測分析［37］、制備免疫親和柱獲取高純度的中藥有效成分［38］、制備單鏈抗體基因提高中藥有效成分的產量［39］、研發單克隆抗體藥物［40］等。

多克隆抗體(PAb)的制備則相對于單克隆抗體簡單，只需利用中藥有效成分半抗原偶聯制備完全抗原后，然后用其對動物進行免疫，當抗體效價符合要求后，即可直接取血分離血清，再行硫酸銨法-葡聚糖凝膠-陰離子交換柱技術即可獲得純化后PAb。PAb可用于制備免疫親和柱剔除中藥或方劑中特定成分［21］、確定中藥有效成分作用靶點［23］等。

6 展望

目前國內外對中藥有效成分半抗原研究僅僅停留在單味中藥材的藥物分析層面上，日本九州大學正山和田中實驗室獲得了近40種針對中藥有效成分的單克隆抗體，但并未到達中成藥、復方制劑、中藥有效成分制劑的高度;復方中藥的有效成分的藥理分析，尤其是有關方中的配伍規律及作用機制方面的報道則相對較少，這一方面固然是復方中藥組成的多樣性和活性成分的作用多靶標有關，導致對每種活性成分的篩選和純化、藥理分析的困難;另一方面也說明目前的有效成分的篩選和評價模型尚待改進。中藥有效成分是使中藥具有治療作用的物質基礎，對于復方中藥而言，其總的療效并非是多個活性成分生物效應的簡單疊加，其間存在著可能的協同或拮抗等相互作用不可忽視，而應是其主要有效成分以及次要成分相互作用的綜合效應。因此，目前普遍采用的分離單一活性成分進行藥理分析的方法不能反映復方中有效成分之間以及與次要成分之間相互作用的實際情況。而利用中藥有效成分半抗原抗體建立的免疫分析法則具有前處理簡便、特異性高、分析成本低等特點，特別適用于樣品數目大而活性成分含量低時的分析測定，是中藥生產過程中的質控的可選手段之一，為復方中藥的藥物化學分析和藥理學研究提供了新的技術選擇和可能。本課題組擬將中藥有效成分半抗原免疫分析技術應用于中藥注射劑重癥過敏反應致敏原成分篩查。還有不可忽視的是中藥半抗原抗體還有望被開發成治療藥物:一些中草藥中含有毒性成分，盲目服用或服用過量會對人體造成危害，如果有針對該成分的單克隆抗體，利用抗原抗體的特異性反應，可在病人體內將該毒性成分中和，使其不能發揮生物活性，從而保證病人不受損害。由此可以預見，中藥有效成分半抗原抗體將在中藥現代化領域有著不可替代的優勢與廣闊的應用前景。

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