鈣離子信號通路及相關蛋白激酶對弓形蟲的作用＊

陶 青，趙俊龍

弓形蟲是世界范圍分布的專性細胞內寄生原蟲，可感染人類和所有溫血動物的有核細胞。由于宿主的廣泛性，弓形蟲病已經成為一個全球性的、嚴重的公共衛生問題，不但危害人類健康，而且成為影響畜牧業發展的重要機會性病原體［1］。鈣離子（Ca2＋）是細胞內重要的第二信使之一，在弓形蟲入侵宿主細胞的信號轉導中起著關鍵作用［2］。弓形蟲速殖子內Ca2＋被各種相關信號通路所調節并釋放到胞質后激活依賴Ca2＋的蛋白激酶，進而行使不同的細胞功能［3］。本文綜述了Ca2＋及其相關信號通路和蛋白激酶在弓形蟲獨特生理機制中的重要作用。

1 弓形蟲速殖子中Ca2＋生理特性和功能

Ca2＋濃度在靜止的弓形蟲細胞質中保持著較低的水平，在弓形蟲速殖子運動過程中，Ca2＋水平的變化呈現周期性波動趨勢［3］。胞內Ca2＋貯存在三個鈣庫中，包括內質網、線粒體和酸性鈣離子體，而內質網是弓形蟲貯存Ca2＋最主要的部位。鈣庫對Ca2＋的緩沖作用很大，在調節胞質內Ca2＋濃度中起到關鍵作用［2］。胞內Ca2＋在受到外界刺激后，通過信號通路從鈣庫釋放到胞質中。鈣庫上的鈣離子泵可將胞質中的Ca2＋重新泵入鈣庫，一方面填充由于釋放Ca2＋導致的鈣庫的虧空，另一方面可以降低胞質內Ca2＋濃度，使胞內Ca2＋水平始終處于動態平衡的狀態。近年的研究表明，大多數鈣離子泵是Ca2＋－ATP酶，弓形蟲體內最重要的鈣泵是肌質－內質網 Ca2＋－ATP酶（SERCA）。Nagamune等證實了SERCA在胞內弓形蟲中位于蟲體頂端，便于通過調節Ca2＋水平來影響微線體蛋白的分泌作用，青蒿素或毒胡蘿卜內酯可以通過抑制SERCA的Ca2＋－ATP酶活性來破壞蟲體胞內Ca2＋的動態平衡。因此，SERCA也成為重要的抗弓形蟲的潛在藥物靶標［4］。此外，在弓形蟲體內還有兩個Ca2＋載體，高爾基型 Ca2＋－ATP酶和單體 Ca2＋/H＋增強子，這些鈣離子泵共同保持著胞內Ca2＋水平的穩定。

Lovett等通過fluo－4熒光光度測定研究表明隨著弓形蟲胞內Ca2＋濃度的增加，有關蟲體運動性的蛋白質如微線體蛋白2（MIC2）開始分泌，而胞外Ca2＋不是弓形蟲運動性的必需因素。在弓形蟲滑行運動過程中，胞內Ca2＋從鈣庫釋放，Ca2＋濃度隨蟲體運動周期性波動，而蟲體在入侵宿主過程中和進入宿主細胞內的初期Ca2＋濃度驟降［5］。Wetzel等通過卡米達佐藥物刺激試驗闡述了胞內Ca2＋濃度在弓形蟲滑行過程中的周期性波動伴隨著微線體蛋白的分泌，并且胞內Ca2＋濃度周期性的波動變化是弓形蟲運動的主要動力。某些藥物在影響Ca2＋波動振幅的情況下不會增強弓形蟲滑動性，而增加波動頻率則會顯著增加蟲體滑行運動［6］。

2 有關胞內Ca2＋釋放的信號通路

弓形蟲鈣庫內的Ca2＋通過兩個主要的信號通路—蘭尼堿樣通路和三磷酸肌醇通路［7］被釋放到胞質中，激活相關蛋白激酶，行使第二信使的功能。

2.1 蘭尼堿樣信號通路 蘭尼堿樣通路被環化核苷酸二磷酸核糖（c ADPR）所調節［7］。弓形蟲受到包括宿主自然配體等外界刺激，體表接收器發出識別信號后激活c ADPR環化酶，使其行使環化功能，以NAD＋為原料催化合成c ADPR。c ADPR可作為第二信使結合到蘭尼堿樣受體，進而激發鈣庫中的Ca2＋釋放到胞質中。

2.2 三磷酸肌醇通路 以三磷酸肌醇（IP3）為第二信使的信號通路是弓形蟲體內介導胞內Ca2＋釋放的另一條重要途徑。Lovett等通過藥理學現象發現乙醇作為天然的Ca2＋刺激劑，可以增加弓形蟲體內的IP3含量［7］。與蘭尼堿樣信號通路相似，當蟲體接觸宿主細胞配體或外界刺激后三磷酸肌醇信號通路被激活。底物磷脂酰二磷酸肌醇在磷脂酶C的作用下產生乙酰甘油，同時，釋放第二信使IP3到胞質中來介導胞內Ca2＋的釋放。

3 Ca2＋相關分泌蛋白及功能

Ca2＋做為胞內重要的離子信號介導了多種弓形蟲生命過程中必不可少的一些分泌蛋白的釋放和調節，在弓形蟲的滑行運動、入侵和逃離過程發揮了關鍵作用。

3.1 Ca2＋介導微線體蛋白2（MIC2）的分泌MIC2由弓形蟲微線體分泌，最初以小囊泡形式被分泌出來，當弓形蟲與宿主細胞接觸后，微線體蛋白囊泡融合，定位在弓形蟲頂部表面［8］。在弓形蟲入侵過程中，MIC2分泌到蟲體頂部后在蛋白酶的水解作用下開裂為胞質內尾區、跨膜區和胞外尾區［9］。胞外尾區可與宿主細胞表面特異受體結合從而使弓形蟲粘附到宿主細胞表面。而胞質內尾區則與弓形蟲醛縮酶相互作用，并與肌動蛋白相連接促發弓形蟲的運動能力。MIC2的分泌可以被Ca2＋載體激發，且只受到胞內Ca2＋水平的影響，Wetzel等用卡米達佐刺激胞內Ca2＋濃度升高可以顯著增加MIC2的含量，進而促進弓形蟲滑行運動，相反，當螯合了胞內Ca2＋后可抑制 MIC2的釋放［4］。

3.2 脫落酸（ABA）介導Ca2＋的釋放 最近的研究表明一種植物樣通路可以通過ABA控制蘭尼堿樣信號途徑來刺激Ca2＋的釋放，進而使弓形蟲逃離宿主。ABA在頂器門寄生蟲中由類異戊二烯途徑衍生而來，在弓形蟲胞內裂殖生殖過程中逐漸富集，導致c ADPR的增加而激活蘭尼堿樣通路，最終使胞內Ca2＋不斷釋放而引發弓形蟲的逃離。Nagamune等用氟啶酮來封閉ABA的生物合成，導致弓形蟲無法逃離宿主細胞。由于ABA的缺乏，使弓形蟲對環境條件變化的敏感性增強，因此，促進弓形蟲速殖子進入一個慢性生長的緩殖子分化時期，最終形成休眠狀態的組織包囊［10］。

3.3 Ca2＋介導穿孔素樣蛋白（PLP1）的分泌 弓形蟲速殖子的細胞逃離作用同樣需要另一種微線體蛋白的參與，即穿孔素樣蛋白（PLP1），同時要求胞內Ca2＋的促發作用來助于PLP1的釋放。PLP1能夠對弓形蟲自身的納蟲泡和宿主質膜有裂解作用，使膜表面出現孔隙和缺口，有助于弓形蟲逃出宿主細胞。PLP1敲除的弓形蟲喪失了從納蟲泡釋放速殖子的能力，說明PLP1對弓形蟲正常生長和免疫逃避至關重要。Kafsack等證明了PLP1由微線體釋放，并依賴Ca2＋濃度的調節。當加入Ca2＋載體后PLP1分泌量顯著增加，并隨著Ca2＋濃度的逐漸升高而增加。用胞內Ca2＋螯合劑去除胞內Ca2＋后，PLP1的分泌也被封閉［11］。另外，弓形蟲可以通過感受胞內鉀離子（K＋）水平的降低來感知宿主細胞外界或自身引起的損壞，隨后，一系列的Ca2＋壓力通路被激活釋放Ca2＋來調節弓形蟲逃離宿主細胞。

4 Ca2＋相關激酶和功能

弓形蟲速殖子的滑行運動、宿主細胞入侵和逃離是弓形蟲整個生活史中的關鍵生命進程，亦是弓形蟲急性致病的主要原因。弓形蟲的所有運動過程都需要MIC2的細胞粘附作用，而MIC2的釋放是受到嚴格調節控制的，這樣才能避免宿主機體免疫系統的清除作用。一些蛋白激酶在Ca2＋信號的激活作用下，對MIC2的分泌調節起到了重要作用。早期的研究證明至少有兩種不同的蛋白激酶控制著MIC2的分泌，分別是環GMP依賴激酶，即蛋白激酶G（PKG）和鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）。

4.1 絲氨酸/蘇氨酸激酶對微線體蛋白分泌的作用

蛋白激酶G（PKG）屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，在Ca2＋的激活下成為促使微線體蛋白分泌的重要途徑。Wiersma等用一種叫做Cmpd 1的選擇性寄生蟲抑制劑來封閉PKG的作用［12］。Cmpd 1是一種吡咯－吡啶化合物，可抑制弓形蟲MIC2的分泌，從而抑制弓形蟲的細胞入侵和運動力。在Ca2＋存在的環境下，隨著加入Cmpd 1的濃度升高，MIC2的分泌逐漸減少，當螯合了胞內Ca2＋后，MIC2的分泌被完全封閉。由于弓形蟲的細胞入侵和滑行運動都要依賴于MIC2的分泌，PKG的蛋白質磷酸化作用無論在微線體蛋白對膜結構的錨定作用中還是在弓形蟲頂部與膜結構的融合中都發揮了重要作用。然而PKG作為分子藥物靶標在體內還未得到證實，需要進一步的試驗研究。

4.2 鈣依賴蛋白激酶（CDPKs）的結構和作用 作為Ca2＋信號的重要效應因子，CDPKs家族的蛋白激酶承擔了刺激微線體蛋白釋放的主要任務。胞內Ca2＋水平增加激活CDPKs作用于微線體，促使微線體蛋白的釋放。CDPKs廣泛存在于植物、纖毛蟲及原生動物細胞內，而不存在于動物和真菌［13］，因此，CDPKs作為有效的藥物靶標更優于任何一種動物體內所含有的蛋白激酶。

典型的CDPKs結構在氨基端有一個可變區與催化區域相連接，在羧基端則擁有一個激活區域（CAD），CAD由連接區和調節區（鈣調蛋白樣區域）構成［13］。CAD是CDPKs最重要的功能區域，調節著整個蛋白激酶的活化和抑制形式，這是由于此區域羧基端包含典型的EF hand結構。EF hand可以結合Ca2＋使處于抑制狀態的CDPKs激活而行使蛋白激酶功能，而連接催化區和調節區的連接區亦叫做自動抑制區，該區域以假底物的形式結合到催化區使蛋白激酶處于抑制狀態［13］。CDPKs執行功能需要ATP提供能量，在催化區域內的ATP結合位點中擁有一個獨特的看門氨基酸殘基，是控制蛋白激酶發揮作用的中樞部位，當看門氨基酸殘基突變后就會影響激酶與ATP或激酶抑制劑的結合，導致蛋白激酶的失活或對抑制劑敏感性降低［14］，從而影響微線體蛋白的釋放。Ojo等用一種特殊的蛋白激酶抑制劑BKLs來封閉TgCDPK1的活性，使BKLs與ATP形成競爭關系而結合到ATP結合位點。而將TgCDPK1的看門氨基酸殘基半胱氨酸突變為天冬氨酸后，由于改變了ATP結合位點的空間大小而明顯降低了TgCDPK1對BKLs的敏感性［14］，因此，開發CDPKs的選擇性抑制劑具有廣闊的前景。

與植物中CDPKs相似，弓形蟲的CDPKs結構也變化多樣，和植物與纖毛蟲中典型的CDPKs結構相比較，并以催化區域為基礎，TgCDPKs結構可分為5個主要類型［3］。典型的結構包括氨基端的激酶催化區域和羧基端的4個EF hand。第二類典型的TgCDPKs除了包含4個EF hand外，在催化區域的氨基端有一段稍長的未乙?；牟糠郑δ芪粗?。另外一類只擁有3個EF hand，這種結構與植物的鈣離子－鈣調蛋白依賴蛋白激酶（CCa MK）相似［15］。第四類TgCDPKs的EF hand在催化區域的氨基端，且EF hand的個數可以是一個或者更多。最后，弓形蟲還擁有一大類特殊的CDPKs，除了具有典型的CDPKs結構外，在氨基端還有兩個或更多的EF hand，同時，有一個plekstrin homology（PH）區域連接了EF hand和催化區域。由于TgCDPKs結構各異，表明其功能多種多樣，對TgCDPKs的結構和功能研究成為當今弓形蟲研究的熱點。

5 結 語

弓形蟲Ca2＋信號通路和相關蛋白激酶的作用機制是十分復雜的，但在弓形蟲整個生活史中起到了至關重要的作用。Ca2＋和相關蛋白激酶不僅參與了弓形蟲速殖子從滑行運動、宿主細胞入侵和逃離的整個過程，而且宿主細胞對Ca2＋的通透性也是宿主抵抗弓形蟲的重要步驟。在弓形蟲的所有運動過程中，Ca2＋通過蘭尼堿樣通路和三磷酸肌醇通路釋放到胞質內，被釋放的Ca2＋結合PKG和CDPKs導致微線體蛋白的分泌，Ca2＋與相關蛋白激酶促發微線體蛋白的釋放，這在弓形蟲獲得運動能力中起到關鍵作用。MIC2的細胞表面粘附作用使弓形蟲具有入侵和逃避宿主細胞的運動性。Ca2＋及其相關蛋白激酶已成為如今研究弓形蟲致病機制的熱點，現有的研究結果和資料對整個Ca2＋信號通路和蛋白激酶作用機理的闡述不足以精確描述整個過程的作用機制，如弓形蟲其他分泌器官的新蛋白的功能研究，Ca2＋其他受體對整個信號通路的作用機制等。

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