副結核病診斷抗原研究進展＊

徐鳳宇，姜秀云，么乃全，錢愛東

2.吉林農業大學動物生產及產品質量安全教育部重點實驗室，長春 130118；

3.吉林農業大學生命科學學院，長春 130118

副結核病是由禽分枝桿菌副結核亞種（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis，MAP）引起的多種動物共患的慢性、腸道肉芽腫性傳染病，也稱Johne＇s病，呈世界性分布，在我國被列入二類動物疫病。調查表明，美國大約20%～40%的奶牛群感染MAP，常導致產奶量下降及體重減輕，每頭感染牛每年的損失約＄227［1］。由于目前針對該病的疫苗存在干擾檢疫等缺點，所以根除的最好辦法是盡早檢出、隔離或淘汰病畜。該病原的檢測方法有多種，如直接鏡檢、分離培養、分子生物學檢測、噬菌體生物擴增技術等［2］，但這些方法或敏感性不高，或耗時長，且在疾病的亞臨床階段揭發率較低，而恰恰該病的亞臨床期較長，所以降低了以上方法在臨床診斷中的應用價值。血清學方法和遲發型過敏反應可快速、有效地診斷該病，有些方法能檢出亞臨床病例［3］，但目前這些以抗原為基礎的檢測方法所用抗原多為復合物，與其它分枝桿菌存在交叉反應，而環境中的腐生分枝桿菌等又常侵襲動物，所以使用復合抗原檢測的特異性不高，限制了其在臨床檢測中的應用。所以，近年很多研究與優化診斷抗原相關，隨著該病原基因組全序列的揭曉，這項工作的進程也在加快，特綜述之。

1 復合抗原

為提高副結核病診斷的特異性，有學者對MAP的蛋白組分進行了研究。Cho等［4］比較了該菌產生的培養濾液（culture filtrates，CF）和細胞提取液（cellular extracts，CE）的蛋白質組，研究了二者的抗原性，發現CE蛋白分子量范圍較寬，有的蛋白達100 ku，而多數CF蛋白分子量小于50 ku；二維電泳結果表明：CF蛋白的等電點（pI值）很窄，多為p H 4.0～5.5，CE蛋白的pI值為p H 4.0～7.0；用MAP自然感染的牛血清進行免疫印跡分析，與血清發生反應的CF蛋白較多，暗示進行血清學檢測時，可用CF代替CE；但即使是以CF蛋白為抗原，也不能檢測所有的MAP陽性牛，尤其是在感染早期未產生足夠的抗體應答時。在此基礎上，該課題組以MAP JTC303株CF蛋白為抗原，將待檢牛血清、牛奶用草分枝桿菌的細胞提取物吸收去除其中的交叉抗體，建立了JTC－ELISA方法，與5個商業ELISA試劑盒相比，診斷的敏感性明顯提高，特異性也很穩定，尤其在糞排菌率較低的病例中應用效果更好，敏感性為40%，而商業試劑盒的敏感性為20%［5］。我國何昭陽等［6］采用除去草分枝桿菌抗原或其類屬抗原的辦法，制備了親和層析抗原和草柱親和抗原，建立的ELISA檢測方法表現出了良好的特異性，其中草柱親和抗原制備更容易，收獲量多，有利于大批量生產應用，將其應用于臨床中效果非常好，尤其適用于消除PPD－ELISA產生的假陽性反應。

2 特異抗原

2.1 細胞免疫診斷抗原

2.1.1 Ag85復合物 作為分枝酰轉移酶家族，Ag85復合物存在于MAP培養濾液中，大小約30～32 ku。一方面，它是MAP、牛分枝桿菌、結核分枝桿菌等的保護性抗原，亞單位疫苗的候選抗原之一；另一方面，它能有效增強MAP感染10周左右的牛產生體外IFN－γ應答，其中Ag85A（MAP 0216）和Ag85B（MAP 1609c）合成肽作用強于Ag85C（MAP 3531c）；用實驗感染牛鑒定發現，Ag85B的T細胞表位在第145～162個氨基酸之間；應用重組并純化的Ag85A和Ag85B檢測感染MAP的犢牛會產生增殖反應，作為T細胞抗原可以早期識別自然感染牛［7］。

2.1.2 MAP1204和 MAP1087 Bannantine等［1］分析了92個重組的MAP蛋白（包括Ag85復合物），發現有兩個可能的抗原很適合作為副結核病牛的早期（感染后70天）檢測，這兩個蛋白分別由MAP1087和MAP1204編碼，大小分別為146、244個氨基酸，且兩個蛋白聯合應用能檢測出更多的亞臨床病牛，為該病的早期診斷提供了思路。

2.1.3 MAP41 2005 年，Nagata 等［8］獲 得 了MAP10、MAP39和MAP41（后兩者為PPE家族成員，分別由MAP3184、MAP1518基因編碼）的核苷酸序列，并用大腸桿菌表達了此三種蛋白，發現它們能增強MAP感染牛外周血單核細胞產生IFN－γ的能力。一般而言，感染MAP的牛血細胞在用MAP抗原刺激后會產生大量IL－10，從而抑制T細胞產生IFN－γ，可以作為重要的診斷指標。2010年，該研究者［9］發現MAP41可誘導接種MAP兩周后的實驗牛產生IL－10，檢出的時間早于IFN－γ，產生的量高于其他分枝桿菌感染的牛，在以豚鼠為實驗動物時也得到了相似的結果。此研究表明，MAP41檢測IL－10水平可以作為一種有效的檢測方法，而且能提前檢出時間，減少帶菌動物排菌污染環境并對其他動物及人類造成的威脅，有利于更好地控制副結核病。

2.2 體液免疫診斷抗原

2.2.1 34 ku蛋白 34 ku蛋白的編碼基因是從MAP的λgt11文庫中篩選到的，該基因包含三部分。最初的研究表明，其編碼的13.6 ku羧基端（a362）與所有檢測的MAP發生反應而不與其它20株菌包括禽分枝亞種禽亞種（MAA）和胞內分枝桿菌發生反應。免疫電鏡觀察發現在MAP表面存在a362多肽，用重組的a362多肽作ELISA抗原，結果能對所有檢測的感染牛及疾病所有階段的血樣準確分析，認為該蛋白的羧基端含有種特異性表位，曾被用于牛副結核病的ELISA特異性診斷中。但是，2007年 Malamo等［10］制備了a362的單克隆抗體（MAbs），在ELISA和免疫印跡實驗中，2株單抗均與MAA、胞內分枝桿菌發生交叉反應，重組蛋白也與3種分枝桿菌的兔多克隆抗體發生反應，表明該蛋白羧基端有MAP、MAA及胞內分枝桿菌共有的抗原決定簇，在自然感染牛體內很容易誘導抗體產生，共有決定簇降低了34 ku蛋白的羧基端用于診斷的特異性。

另外，Willemsen等［11］發現9、15和34 ku蛋白（分別由MAP2609、MAP2942c和MAP0210c編碼）與結核桿菌的TB8.4、MPT53和Erp抗原具有很高的同源性，且都能被臨床或亞臨床感染牛的抗體識別，三者均為分泌抗原，可能被用作診斷抗原。經過氨基酸序列比較，此處的34 ku蛋白與前述的34 ku并非同一物質。

2.2.2 35 ku抗原 Zaatari等［12］克隆并表達了分子量35 ku的抗原（p35 Ag），發現編碼此蛋白的基因（p35）只與禽分枝桿菌復合群的DNA雜交。用感染或未感染的57只動物參考血清進行免疫印跡，發現它能100%識別處于臨床期動物（12頭牛、2只山羊和2只綿羊）的血清，對處于亞臨床階段的20頭牛的血清識別率為75%，而15頭非MAP感染奶牛、3頭BCG接種的牛、3頭人工大劑量接種MAP的奶牛血清不能被p35 Ag識別。總的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為86%、100%、100%和75%，p35 Ag免疫印跡的準確率超過了當時商業上可用的診斷Johne＇s病的方法，推測其可用于副結核病的診斷，其編碼基因可作成探針等用于禽分枝桿菌復合群診斷。

2.2.3 MAP0862 等 Paustian 等［13］通 過 分 析MAP的基因組，鑒定了13個ORF。純化其中的5種蛋白，用其與自然感染的牛、暴露于MAP的鼠和兔的血清進行免疫印跡分析，發現其中MAP0862、MAP3732c和MAP2963c幾乎可以被所有的病牛血清識別；進一步分析MAP0862，發現其只與感染牛血清發生反應，初步確定了其在診斷中的意義。Bannantine等［14］在改進檢測羊副結核病的ELISA研究中發現，用重組蛋白MAP0862和MAP3786做抗原時產生的免疫反應較強，MAP0862能檢出81%的 MAP感染羊。國內遲磊等［15］擴增了MAP0862和MAP2154c，并進行誘導融合表達，得到了76 ku的重組蛋白MAP0862/2154c，為其在診斷中的應用奠定了基礎。

2.2.4 MAP0865和 MAP1637c Leroy等［16］應用生物信息學工具，從MAP的基因組中篩選出87個MAP特有的序列，通過抗原性分析選擇3個具有免疫原性的基因，應用重組純化抗原建立的ELISA檢測方法表明，有兩個抗原特異性高于商品化的試劑盒，達到98%（后者為92%），敏感性達分別為72%和82%，前者與 MAP0865有關，被作者命名為Ag6，后者為MAP1637c。生物信息學方法的應用為尋找侯選抗原提供了思路。

2.2.5 MAP1272c和 MAP2121c等 Li等［17］等用重組表達的MAP1272c和MAP2121c作為抗原，建立了ELISA方法，對7份陽性血清進行檢測，發現前者能檢出7份，后者為能檢出5份，顯示了MAP1272c在血清學診斷方面的潛在價值。Bannantine等［18］（2008年）對43個 MAP重組蛋白進行了研究，表明除 MAP3155c能與Johne＇s病牛血清發生強烈的免疫反應外，Dna K（Hsp70）、MAP2121c能被免疫的鼠和兔血清識別。

Bannantine等［19］建立了檢測血清中MAP抗體的蛋白微陣列，93個重組蛋白被點到硝酸纖維素上，采用健康、牛分枝桿菌感染、MAA感染牛血清鑒定這些蛋白的非特異性，結果表明與MAA感染牛血清交叉反應更強；后又應用自然或實驗感染牛血清識別這些抗原，結果檢測到3個膜蛋白與Johne＇s牛血清發生最強烈的反應，它們是侵襲蛋白、ABC肽運輸透明質酸酶和假定的鳥苷三磷酸蛋白。

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