產志賀毒素大腸桿菌流行病學和stx基因研究進展

周 勇，陳守義

感染產志賀毒素大腸埃希菌（Shiga toxin－producing Escherichia coli，STEC）能引起人嚴重的疾病，包括：出血性腸炎（Hemorrhagic coltis，HC）、血栓性血小板紫癜（TTP）和溶血性尿毒綜合癥（Hemolytic－uremic syndrome，HUS）甚至死亡［1－4］。

目前發現可引起人類感染的STEC有472種血清型，但經常引起人患病的血清型不到10種。Karmail等［5］推薦根據血清分型和致病力強弱將STEC從A到E分成5個型別。A型為致病力最強的血清型；包括O157∶H7和O157∶NM。B型為能引起嚴重疾病和暴發流行但感染發生率較A型低的血清型；例如：O26∶H11，O103∶H2，O111：NM，O121∶H19和O145∶NM。C型與散發的HUS有關，很少引起暴發流行；包括：O91∶H21和O113∶H21。D型通常只引起人腹瀉的散發病例，E型包括其它與人疾病無關的STEC血清型。Scheutz等［6］建議以毒力基因圖譜將STEC分為3組。第1組包括能引起HUS和或能引起暴發流行的STEC；第2組由可引起人腹瀉但不發生HUS的STEC組成；第3組為引起動物疾病的STEC。

1 STEC流行病學概況

STEC感染是動物源性疾病，反芻動物是STEC的自然宿主，其中牛是最重要的宿主［7－8］（在澳大利亞，綿羊是重要宿主［9］）。研究發現除了牛，羊、豬、貓、鹿、馬、狗、家禽和野禽等都可分離到STEC［9－12］。目前發現有超過435種血清型 STEC分離自牛，牛由于缺少志賀毒素（Shiga toxin，Stx）受體所以不致病［7，13－15］。牛 糞便中 STEC 分 離率 與季節有關，夏季分離率較高，相應夏季人類感染STEC患病率也隨之升高［16－17］。此外，未斷奶的小牛STEC分離率較低，斷奶后到成年之間的時段分離率最高，成年后的分離率下降至中等［18－19］。

人感染STEC通常經過進食生的或未熟的肉類、生牛奶或者生食被污染的蔬菜水果而發病，也有在屠宰牲畜和生肉加工時被感染［20］。有研究表明低于100CFU的STEC就能引起人致病，因此直接接觸患者也可引起繼發感染［21］。

2007－2009年，歐盟各成員國每年檢測超過一萬份牛肉樣本，STEC的檢出率為0．3%～2．3%，其中O157∶H7的檢出率為0．1%～0．7%。相比較而言，在蔬菜和水果中的檢出率則低很多，分別是STEC 0．19%和 O157∶H7 0．14%［22］。在英國、加拿大、新西蘭和泰國等STEC檢出率為9%～12%［23－26］，美國華盛頓州的3份研究中，STEC 的檢出率分別是1%、17%、23%［27－29］。在阿 根廷，Parama等［30］從50份碎牛肉中檢出15份STEC陽性標本，在印度，Khan等從111份碎牛肉中查出近50%樣本為 STEC PCR 陽性［31］。

不同國家甚至一國不同地區的檢出率都存在一定差異，有的可能與流行趨勢有關，但也存在實驗技術方面的原因，比如采樣方法的不同、樣本數量的大小和樣本的選擇以及檢測技術的不同（到現在還沒有統一的STEC特別是非O157STEC的檢測標準），此外很多研究主要關注O157∶H7的檢測。這些差異造成各實驗室數據很難進行比較研究。

由于O157∶H7是STEC中致病力最強、流行趨勢最廣、發病率最高的血清型，因此在STEC流行病學研究中，經常將O157STEC和非O157 STEC分成2類來進行分析。自1982年美國首次報道O157∶H7暴發流行以來，近30年不斷有O157∶H7在全球暴發流行和散發病例的報道［32］。1993年美國發生了一次涉及到4個州700余名兒童的O157∶H7暴發，其中41例發生HUS，4例死亡［33］。1996年5－8月在日本發生的O157∶H7暴發流行，患者9 000余名，死亡9人［34－35］。1999－2000年我國蘇皖等地發生的O157∶H7大規模暴發流行，患者約2萬人，發生急性腎功能衰竭者195人，死亡人數177人［36］。而近十年非O157STEC血清型也不斷有感染流行的報道。此次始于德國的O104∶H4暴發流行，涉及13個國家，感染4 125人，發生HUS 892例，死亡49人（2011年7月1日數據），是迄今為止非O157STEC感染暴發流行最嚴重的一次［37］。

在北美 STEC O26、O45、O103、O111 以及O121是最常引起感染的非O157血清型；在歐洲則以 O26、O103、O91、O145為主［12］。歐盟 CDC匯總各歐盟成員國上報的2008－2009年STEC感染病例，其中O157感染占51%～53%，O26占5．3%～5．4%，O103 2．3%～2．8%，O91 1．3% ～1．6%，O145 1．3%～1．6%，未分型及不能分型的占25．9%～28．2%［22］。

STEC感染導致HUS的病例中接近75%發生在兒童，其中年齡低于10歲的兒童最易感。15%感染STEC后有腹瀉癥狀的兒童會發展成HUS，50%的HUS患者最終導致腎衰需要血液透析治療，而HUS致死率接近5%［38－40］。2009年 Hedican在美國明尼蘇達州對O157和非O157STEC感染的特征進行比較，發現O157感染導致的出血性腹瀉（78%比54%）、HUS（7%比0%）和入院率（34%比8%）都比非O157高。同時發現只有當O157菌株攜帶stx2基因時發生出血性腹瀉和入院率比非O157高。此外，在檢測到的非O157中，74%的血清型屬于O26、O103、O111、O145、O45等5個血清型［41］。Gould在另一項研究中也比較了2者的HUS發生率（O157 6．3%比非 O157 1．7%）、入院率（O157 42% 比 非 O157 12%）、死 亡 率 （O157 0．6%比非O157 0．1%）。而在這項研究中，82%的非O157菌株屬于 O26、O111、O103、O121、O145、O45等6個血清型［42］。

2005－2009年，歐盟成員國共有16 263份人感染STEC的病例報告。其中在2009年有3 573份確認病例，發病率是每十萬人0．75。發病率最高的是愛爾蘭，09年確認病例237份，發病率為每十萬人5．33；其次是丹麥，確認病例160份，發病率每十萬人2．9。在2007－2009年，9 637份確認病例中548份發生HUS（占6%），其中71%由O157引起，15%由O26引起。2006－2009年，歐盟成員國每年因為STEC感染而致死的人數是2～6人［22］。

2 stx基因及其分型概述

志賀毒素（Shiga toxin，Stx）由位于STEC染色體上的前噬菌體攜帶的stx基因編碼。Stx是STEC的主要毒力因子，包括2個沒有抗原交叉反應的 Stx1（VT1）和 Stx2（VT2）。1977年，Konowalchuk等［43］發現某些大腸桿菌可產生一種對非洲綠猴腎細胞有致死作用的細胞毒素，將其命名為Vero細胞毒素（Vero cytotoxin，VT）。VT屬于Stx家族，包括Ⅰ型痢疾志賀菌表達的Stx以及VT1、VT2。VT1與Ⅰ型痢疾志賀菌表達的Stx的序列同源性達99%。由于VT與Stx的高度同源性，一開始它們也被命名為志賀樣毒素Ⅰ型（Shigalike toxinⅠ，SLTⅠ）和志賀樣毒素Ⅱ型（Shiga－like toxinⅡ，SLTⅡ）。1994年，O’Brien推薦SLT和VT都可以用來命名大腸桿菌產生的志賀毒素。2年后，Calderwood建議取消Shiga－like toxin名稱中的“like”，直接使用Stx來命名志賀毒素同時VT的命稱保留并可與Stx互換。此后，這一建議被廣泛采用［44］。

目前研究發現Stx1和Stx2都有變種，Stx1有2個變種Stx1c和Stx1d［45］，Stx2至少有12種變種（Stx2c、Stx2－O113、Stx2－O48、Stx2vh－a、Stx2vh－b、Stx2d－OX3、Stx2－OX3b、Stx2d－O111、Stx2d－O118、Stx2e、Stx2－NV206和Stx2g），并不斷有新的變種被發現［46－48］。Bertin［46］用 PCR擴增編碼Stx2B亞單位的基因片段，然后用HaeⅢ、RsaⅠ、NciⅠ分別酶切擴增的基因片段，通過酶切產生的片段大小來對stx2進行分型。現在這種PCR－RFLP方法是常用的stx分型方法。Beutin［45］則用BstEⅡ、HaeⅡ、PflMⅠ酶切編碼Stx1B亞單位的PCR擴增產物將Stx1的編碼基因分成stx1、stx1c、stx1d等3種亞型。

STEC由于血清型眾多，單從血清分型無法得到菌株攜帶毒力基因的情況也就無法判斷菌株致病力的強弱，因此利用分子生物學方法對STEC菌株的毒力基因進行分型是常用的STEC分型方法。除了上述的 PCR－RFLP方法，Persson［48］等使用2對引物對StxAB2操縱子的部分特異性片段（491 bp）進行擴增，然后測序，再將序列與GenBank上的序列進行對比，結果發現該方法可以對stx2基因進行分型。測序方法可以避免PCR－RFLP分型的某些缺陷，比如序列中存在單核苷酸的改變、酶切片段太小以至電泳無法分辨或者存在相同大小的片段等。在此研究中，Persson采用Schetuz的建議對STEC菌株采用O血清型加菌株名稱加stx2基因型的模式進行分型。利用這一原則，Persson等將255株從患者中分離到的STEC分成12個亞型。其中，Stx2－O157－EDL933、 Stx2－O48－94C、 Stx2c－O157－FLY16、Stx2c－O157－C394－03、Stx2－O157－EDL933＋Stx2c－O157－FLY16、Stx2－O48－94C ＋ Stx2c－O157－FLY16分離自HUS患者。此外，PFGE在相同血清型菌株之間的分型可以用于流行病學調查和感染溯源。

3 stx基因及其亞型與臨床癥狀關系的研究

每一STEC菌株只會攜帶一種stx1基因，但可以攜帶2種stx2基因，某些菌株可同時攜帶一種stx1基因和1種或2種stx2基因。目前的研究熱點在于不同的stx基因型與人類疾病的關系。stx1和stx2d主要多見于引起腹瀉癥狀但很少導致HUS的菌株；stx2和stx2c常見于引起HUS的菌株；攜帶stx2e的菌株最早分離自患水腫病的豬［49］；stx1c和stx2d－O118分離自綿羊［50－51］；stx2f 分離自鴿子［52］。Feriedrich［53］等對分離自HUS患者的268株STEC和有腹瀉但無HUS患者的262株STEC以及無癥狀攜帶者的96株STEC進行stx基因型的分析，發現stx1主要分離自腹瀉患者和無癥狀攜帶者，stx2主要分離自HUS患者，此外stx1＋stx2和stx2＋stx2c也可分離自HUS患者。這項研究和世界各地的研究基本一致，即單獨攜帶stx2的菌株最易引起HUS，然后是stx2＋stx2c，單獨攜帶stx2c的菌株則較少引起HUS，單獨攜帶stx1的菌株罕見引起HUS［48，54］。很多研究發現大部分 O157菌株只攜帶stx2基因，因此O157是引起HUS的主要血清型。此次德國暴發流行的O104∶H4也是單獨攜帶stx2基因［55］。Eklund等［54］通過細胞毒性實驗和反相乳膠凝集（RPLA）測定STEC菌株產志賀毒素的能力和滴度，發現攜帶stx2基因的菌株產生志賀毒素的滴度比攜帶stx1和stx2基因亞型的菌株高。

4 其它毒力因子與疾病關系

eae基因編碼緊密黏附素（Intimin），介導細菌與宿主小腸上皮粘膜的黏附，能引起黏附和抹平損傷（Attaching－effacing lesion，A／E lesion）。很多研究認為STEC引起人類HUS的原因很復雜，僅僅Stx的參與還不夠，還需要Intimin的協同作用，但目前這一機制仍不清楚。Intimin N末端較保守，C末端280個氨基酸（IntC280）是與其受體結合的區域，在不同血清型菌株中差異較大。目前根據編碼Intimin C末端的eae基因序列的差異可將其分為21個亞型（α1、α2、β1、ξR／β2B、δ／β2B、κ、γ1、γ2、θ、ε1、νR／ε2、ζ、η1、η2、τ1、μR／τ2、λ、μB、νB、ξB、ο）［56］。

某些STEC菌株可表達一種被稱為溶血素（Haemolysin，Hly）的蛋白，是孔道形成蛋白（Poreforming proteins）家族成員，可在靶細胞膜上形成孔道而殺死靶細胞，與出血性腸炎密切相關。Hly由菌株攜帶的質粒上的ehxA基因編碼［57］。

STEC攜帶的數種毒力基因及其亞型在引起宿主疾病發展中的協同作用仍需要進一步研究去闡明。但流行病學調查發現某些血清型及某種毒力基因亞型常引起人感染發病。Mora等［56］1995－2003年在西班牙盧戈從785份牛肉標本中檢出96株STEC，其中29%攜帶stx1、51%攜帶stx2、20%（stx1＋stx2）、26%eae、45%ehxA。他們把血清分型和毒力基因分型結合起來分析，所有分離菌中O157∶H7 stx1stx2eae－γ1ehxA 有5株，O8∶H21 stx2和ONT∶H21 stx1各 4 株，O26∶H11 stx1eae－β1 ehxA和O64∶H5 stx1各3株，而這幾種血清毒力分型的菌株也頻繁地從當地的腹瀉患者中分離檢出。Eklund［55］等分析173株從患者中分離的STEC菌株，根據血清型和毒力基因型將173株分成10個組。其中毒力最強一組的毒力圖譜是O157∶H7∶stx2stx2c：eae：ehxA，共有55株。這55株中有9株分離自HUS或TTP患者，30株分離自出血型腹瀉患者，8株分離自非出血型腹瀉患者，7株分離自非癥狀攜帶者，1株無相關數據。第2組屬于O145∶H28／H ：stx2：eae：ehxA，有7株，其中3株分離自HUS或TTP患者，3株分離自非出血型腹瀉患者，1株分離自非癥狀攜帶者。這些研究說明除stx基因外，eae和ehxA可能都參與了疾病的發展。目前發現eae和ehxA陽性的菌株大部分屬于腸出血型大腸桿菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC），其中 O157、O26、O111、O145等是重要血清群。近期在德國暴發流行的O104∶H4屬于腸聚集型大腸桿菌（Enteroaggregative Escherichia coli，EAggEC），研究其毒力基因發現其僅攜帶stx2，stx1、eae、ehxA 均陰性，O104∶H4的stx2與O157∶H7ATCC EDL933的stx2核酸序列僅有一個堿基的差異，而氨基酸序列100%相似。O104∶H4攜帶有腸聚集型大腸桿菌的標志性毒力基因aggR、aatA、aggA等基因，但缺少eae使其粘附機制與典型的STEC有所不同，這也可以解釋為什么O104∶H4主要引起成年人患HUS，而不像典型STEC那樣主要引起兒童患HUS。不產志賀毒素的O104∶H4曾在多個國家引起嬰幼兒持續性腹瀉和AIDS患者腹瀉，也有產志賀毒素的O104∶H4的散發病例報道［54］。但不產志賀毒素的O104∶H4通過什么途徑獲得stx2基因以及O104∶H4攜帶的腸聚集型大腸桿菌的標志性毒力基因與stx2基因如何在疾病發展中協同作用仍需要進一步研究去證實。

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