低氧影響干細胞成骨分化的研究進展*

劉曉奇， 閆景龍

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院骨四科，黑龍江哈爾濱150001)

氧穩態是機體或細胞正常功能所必需的，低氧是人正常發育的一個重要的生理因素，并參與許多疾病的發生、發展。在骨發育過程中，組織和細胞缺氧是經常存在的。體內生長板軟骨增殖區氧濃度僅為2% －5%，肥大區氧濃度為 0.15% －1%[1]。機體損傷后，由于損傷部位血流中斷或血腫形成，造成局部氧分壓降低。在骨折血流中斷處，中央部位氧分壓甚至降低到0% －2%[2，3]。骨折修復需要機體在骨折部位重建血運，以便吸收損傷組織和轉運營養物質。在機體代謝過程中，組織細胞內氧穩態的維持由多種生理因素調控，其中低氧誘導因子1(hypoxia inducible factor－1，HIF－1)是目前發現的最重要的調控因子，在調控局部和系統低氧反應中起著關鍵作用[4]。骨折之初，血管損傷，血供減少甚至中斷，導致骨折局部呈低氧狀態，處于骨折局部低氧環境中的細胞將有可能通過低氧 /HIF－1反應通路而發生功能調整性變化，從而參與調節或影響骨折愈合的進程[5]。

全身或局部的血供減少導致的氧含量下降，均會引起骨代謝的改變，導致骨量丟失。現就近年來關于低氧對細胞分化及功能的影響做一下介紹。

1 低氧對細胞分化功能的影響

將間質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)短暫暴露在低氧中對MSCs的生存并沒有產生明顯影響[7]。降低氧張力嚴重損害了人MSCs的脂肪化和成骨化分化能力。提升氧濃度從1%到3%則可恢復其成骨分化能力。同時，低氧能夠提升軟骨細胞分化和軟骨基質合成;這種低氧誘導現象可能在軟骨細胞分化和軟骨內成骨過程中起到加強和保護軟骨表型和功能的作用[6]。蔣能剛等[7]研究指出在正常血清培養條件下，MSCs對低氧有較好的耐受性，48 h后低氧可顯著促進干細胞增殖。金小嵐等[8]認為低氧可以明顯抑制骨髓基質細胞向脂肪細胞分化而促進其向成骨細胞分化。Salim等[9]也發現低氧對MSCs成骨性分化幾乎沒有影響，相反，體外實驗短時間低氧抑制了成骨細胞和間質前體細胞骨小結形成和細胞外鈣沉淀。Gruber等[10]指出骨細胞在低氧條件下培養72 h，代謝活動逐漸減少;低氧抑制細胞有絲分裂反應與成骨性分化標志物堿性磷酸酶和骨鈣素的表達。當骨細胞再次在正常氧含量下培養7 d后，它們的反應性恢復正常。這些發現表明低氧條件下成骨細胞可以短暫生存，但生長分化能力降低。氧含量恢復后，它們增殖分化能力恢復正常，這也暗示復氧或血管形成是骨折愈合的關鍵一步。

2 低氧對干細胞成骨分化時相關細胞因子表達的影響

低氧可通過調節干細胞某些細胞因子的表達，影響細胞的功能。有研究認為低氧降低了人成骨樣細胞Runx2/Cbfa1的表達－低氧96 h后，Runx2、I型膠原和堿性磷酸酶mRNA的表達都減少，并呈時間依賴性，堿性磷酸激酶的活性也以同樣的方式減少[11]。同時低氧也下調BMP－2和Runx－2表達，阻礙多潛能間質前體細胞和成骨細胞成骨性分化[9]。2007 年 Potier等[12]也證實將 MSCs短暫暴露在低氧中導致:(1)Cbfa1/Runx2、骨鈣素和Ⅰ型膠原持續下調(直到暴露后的14 d);(2)持久上調骨橋蛋白mRNA的表達(直至暴露后的28 d)。Nagano等[13]移植高醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)的MSCs使骨產生早期的修復和骨質替代，高ALDH的MSCs對低氧有更高的反應性，上調Flt－1、CXCR－4和 angiopoietin－2的表達。Christopher等[14]也發現低氧壓抑CXCL－12的表達是細胞因子誘導成骨細胞移動的關鍵一步。低氧可使循環骨髓衍生成骨前體細胞通過CXCR4/SDF－1途徑募集到骨修復部位[15]。骨樣細胞比成骨樣細胞表達產生更高的ORP－150，低氧培養提升礦化基質的合成，堿性磷酸酶活性在早期低氧培養時增加，但在成骨時減少;低氧張力提升了成骨細胞分化和繼之的骨細胞形成[16]。并且低氧誘導最初的成骨細胞表達IGF －II而非 IGF －I[17]。Gross等[18]指出體內急性失用和體外直接低氧可導致成骨細胞快速上調OPN表達。在OPN可促進破骨細胞遷移和黏附的背景下，低氧誘導的成骨細胞OPN表達可能調整失用誘導的骨吸收。低氧刺激可通過成骨細胞HIF－1α、ILK/Akt和mTOR途徑加強BMP－2 mRNA和蛋白水平[19]。

3 低氧預處理對干細胞活性的影響

干細胞成骨分化時的活性同樣受到氧張力的影響。Volkmer等[20]指出骨前體細胞如hMSCs定居在低氧環境中，而且，在體外3D培養條件下氧含量也較低。甚至移植入體內后在血管還沒形成前也處于低氧狀態。他們首次指出在成骨誘導前低氧預處理hMSCs，保存了其在低氧條件下成骨性分化的潛能。低氧預處理增加人MSCs的能動性和改進了治療潛力。MSCs在低氧下培養增加了遷移率，并誘導表達cMet－肝細胞生長因子的主要受體(體內遷移和肝細胞生長因子的反應性被認為是MSCs募集和活性的關鍵調節因素)。在鼠缺血部位注射低氧預處理的MSCs后，血流的恢復明顯提前。他們的研究表明在植入前低氧預處理MSCs可以改進組織再生潛能[21]。Kubo等[22]發現移植低氧預處理的細胞導致缺血組織血管化程度增加，并加強了干細胞治療的形態和功能上的益處。低氧預處理顯著增加了各種抗氧化和生存基因的表達。相比在氧含量正常條件下培養，低氧預處理的細胞可產生較低的氧應激分子聚集且能使更多的細胞生存，經28 d治療后，缺血肢體的血管密度和血流恢復明顯較好。Tang等[23]最近的研究指出CXC趨化因子SDF－1和CXC趨化因子受體4(CXCR4)的相互作用精密調節缺血導致低氧誘導的骨髓來源循環干細胞或前體細胞的募集。Oh等[24]報道低氧預處理可作為干細胞植入損傷組織抵抗缺血環境的新策略;這種策略改善了植入細胞和宿主細胞在損傷部位的生存力，他們認為低氧預處理脂肪組織來源的間質干細胞增加了細胞的生存能力和標志基因表達。低氧可以提升人MSCs的增殖，加強集落形成能力，并阻止成骨細胞分化[25]。Ceradini等[26]證實內皮細胞表達 SDF －1 指示組織缺血的存在，這種表達可以被低氧誘導因子1直接調節。有意思的是，骨髓環境中同時存在低氧和SDF－1，說明低氧可能是自體干細胞運輸和功能的必要條件。

綜上所述，干細胞對目標組織微環境的耐受是其應用過程中值得考慮的重要因素，體內的氧張力明顯低于體外的細胞培養環境。軟骨的整個代謝過程也是在一個低氧的環境下進行;因此，在細胞治療中，MSCs必需克服低氧環境。研究表明，在MSCs治療中大部分干細胞不能適應長期的低氧環境而發生凋亡，從而影響治療效果。因而，研究低氧對細胞產生的影響，了解低氧條件下細胞增殖、分化的規律就顯得尤為重要。

盡管現在已經對低氧影響干細胞的功能有了較多的認識。但仍有許多問題尚待解釋。如低氧條件下骨形成的調控機制?細胞因子在低氧條件下的表達及參與機制?長期低氧對干細胞增殖和分化有怎樣的影響?這些都需要我們進一步研究。

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