核酸治療的靶向性傳遞

張 濤，王承宇，張 偉，楊松濤，高玉偉，王鐵成，夏咸柱

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021;2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130062)

核酸治療的靶向性傳遞

張 濤1，2，王承宇2，張 偉1，楊松濤2，高玉偉2，王鐵成2，夏咸柱1，2

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021;2.軍事醫學科學院軍事獸醫研究所，吉林省人獸共患病預防與控制重點實驗室，長春 130062)

寡核苷酸包括反義核酸和干擾RNA等，它們能夠為多種疾病提供快速、特異性的治療，具有很高的應用潛力。然而這些分子能否有效地傳遞到特定的細胞和組織對于最終的臨床應用非常關鍵。靶向性的傳遞能夠提高寡核苷酸藥物的特異性和使用效率，使藥物分子能有效到達作用位點，進而發揮它們的治療效果。一些基于不同平臺的靶向性配體傳遞策略已經形成，并能夠很好的發揮其生物學活性。本文針對當前該研究領域的進展提供一個概述。

AS-ODNs;siRNA;靶向性傳遞

寡核苷酸(Oligonucleotides，ONs)作為臨床藥物治療多種疾病的潛力已經越來越引起人們的重視，早期的研究主要集中在反義寡核苷酸上(antisense oligodeoxyribonucleotides，AS-ODNs)，然而以干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)為基礎的治療藥物近幾年得到了快速的發展。其他以核酸分子為基礎的治療藥物還包括微RNA(micro RNA，miRNA)，免疫調節劑 CpG寡核苷酸(CpG oligodeoxyribonucleotides，CpG ODNs)，核酶(ribozyme)和適體(aptamer)等。

1 寡核苷酸傳遞過程中的障礙

作為多聚陰離子大分子，ONs在到達細胞內作用位點的過程中會遇到很多障礙，因此形成一個有效的傳遞系統是非常必要的。沒有天然的機制能促使這些親水小分子穿過細胞膜，同時它們自身的生物學活性也是非常有限的。ONs具有很多優點：長度一般小于30 bp，在傳遞難度上遠遠小于質粒DNA(平均7 kb);能通過化學合成產生，進行大規模生產，且具有較高的純度;能進行化學修飾，具有更好的代謝穩定性和較高的生物利用率。但是ONs在體內傳遞過程中仍面臨著很多問題，使其不能進入特定的靶細胞或組織內部從而有效地發揮其生物學活性。當前ONs在體內傳遞的主要障礙包括［1，2］：1、腎臟的快速清除;2、血液和組織中核酸酶的降解;3、網狀內皮系統中巨噬細胞攝取導致的肝脾吸收;4、不能通過毛細管內皮組織;5、緩慢的和細胞外基質連接并擴散;6、組織細胞無效的內吞;7、不能從內體中有效地釋放。因此ONs若能有效地發揮生物學活性必須避免血液中核酸酶的快速降解及腎臟過濾或網狀內皮系統產生的快速清除;必須穿過毛細管內皮獲得到達靶細胞的入口，使其能夠存在于細胞外基質中;必須能被靶細胞攝取，并能夠從內體中釋放到達細胞內的靶位點。一個有效地傳遞系統除了解決以上障礙同時還應當避免可能會引起的組織毒性或不適的免疫反應。

2 寡核苷酸基礎上的靶向性傳遞策略

許多靶向性策略已經被研究使其能更方便有效的進行ONs在細胞或組織內特異性傳遞。這些策略一般分為兩類：配體-寡核苷酸直接偶聯和配體-靶向性納米顆粒。一般將寡核苷酸的3′或5′端加以修飾以抵抗核酸酶的降解，同時引入靶向性配體像肽段和適體。陽離子聚合物和陽離子脂質是兩種用于包裹寡核苷酸形成納米顆粒的主要材料，這兩類物質能夠特異性的吸附到靶點上，同時這些陽離子納米載體能產生“質子海綿效應”(proton sponge effect)，可以幫助復合物從內體中釋放［3］。

2.1 HDL/LDL介導的傳遞

使用膽固醇進行寡核苷酸的末端修飾是一個有效的傳遞策略，可以提高ONs的穩定性和細胞攝取能力。在體內通過和低密度脂蛋白(low-density lipoproteins，LDL)或高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)相互作用能提高細胞攝取能力。膽固醇和siRNA偶聯后靜脈注射小鼠肝臟能誘導載脂蛋白 B(apolipoprotein B，apoB)的沉默［4］，apoB是膽固醇代謝中固有的蛋白，能夠反應出體內膽固醇的水平。雖然研究顯示需要較高的chol-siRNA劑量，但該研究第一次證明能夠在體內使用這種方法起到 RNAi效應，具有重要的臨床意義。除了Chol-siRNA外，siRNA和膽汁酸、長鏈脂酸、油脂偶聯也能提高體內細胞攝取和基因沉默的能力［5］。研究顯示HDL和LDL是膽固醇和siRNA偶聯的主要載體，清蛋白是寡核苷酸和中鏈脂肪酸偶聯的主要載體。研究還證明siRNA結合物攝取的有效性和選擇性取決于和脂蛋白顆粒、脂蛋白受體和跨膜蛋白Sid1的相互作用。HDL直接使siRNA進入肝臟、消化道、腎臟和生成類固醇的器官，然而LDL靶向性 siRNA主要集中在肝臟。Sterghios將 cholsiRNA通過氣管灌輸進入肺內，這種情況下，在6 h后p38MAP激酶的mRNA沉默效應達30%～45%［6］。最近，Nishina顯示一種新的脂偶聯 siRNA(Toc-siRNA)，將siRNA端連接α-生育酚進行修飾，當體內靜脈注射2 mg/kg的 Toc-siRNA時，能有效地降低 apoB蛋白的表達［7］。

2.2 葉酸鹽(folate)介導的傳遞

葉酸鹽受體(folate receptor，FR)，一種 GPI-錨定的糖蛋白，在核酸藥物傳遞過程中是一個非常有用的靶標。葉酸鹽受體在許多癌癥如卵巢癌，結腸癌，乳腺癌等中都過量表達，在正常組織細胞中的含量比較低。葉酸鹽介導的靶向傳遞具有很多優點，如葉酸分子量非常小、無免疫原性、利用方便、化學合成簡單。葉酸和脂質體、多聚物的結合物能夠使他們結合到腫瘤細胞表面的葉酸受體上，通過內吞作用進入細胞。葉酸已在寡核苷酸的腫瘤靶向性研究中被使用。例如，Rait顯示葉酸受體靶向性的陽離子脂質體比非選擇性的脂質體轉染試劑能更有效地傳遞anti-HER寡核苷酸進入乳腺癌細胞［8］。此外，葉酸包被的陽離子脂質體-寡核苷酸比單獨使用的寡核苷酸顯示出更長的系統循環時間，能夠提高腫瘤的定位［9］。Kim研究顯示聚電解質復合物(polyelectrolyte complex micelle，PEMC)基礎上的納米顆粒(直徑70 nm)可用于葉酸靶向性傳遞AS-ODN。PEMC是由FOL-PEG-ODN復合物與陽離子脂質或脂質體偶聯形成的結合物。PECM誘導肺癌細胞A549和口腔癌細胞KB中GFP表達水平顯著的降低［10］。最近的研究中，Zhang提出一個新的策略用于siRNA的細胞型特異性傳遞，將siRNA非共價的偶聯到葉酸上形成葉酸-寡核苷酸復合物，產生的復合物能夠被特異性的細胞攝取并能顯著沉默靜脈內皮細胞和KB細胞表面葉酸受體的表達［11］。

2.3 轉鐵蛋白(transferrin)介導的傳遞

轉鐵蛋白受體(transferrin receptor，TfR)是在許多腫瘤細胞表面大量表達的糖蛋白。轉鐵蛋白受體介導的內吞在細胞內的路徑已被闡明。內吞的轉鐵蛋白受體能夠通過再次循環到細胞表面而不經過細胞內的降解。和轉鐵蛋白受體特異性的抗體相比較，轉鐵蛋白更易大規模制備和商品化。因此轉鐵蛋白介導的傳遞已廣泛用于各種靶標的研究，包括腫瘤、內皮細胞和腦。一般通過化學方法將轉鐵蛋白、抗轉鐵蛋白受體抗體或抗體片段結合到納米顆粒表面。Heidel將siRNA和陽離子環糊精聚合物壓縮形成納米顆粒，然后利用轉鐵蛋白使其靶向尤文肉瘤(Ewing’s sarcoma)細胞，這種腫瘤細胞高表達轉鐵蛋白受體。當小鼠尾靜脈注射2.5 mg/kg的 siRNA時能夠觀察到特異性 EWSFL11基因表達的沉默，并能相應的抑制腫瘤生長。經過檢測這種環糊精基礎上在系統性傳遞并不會引起相關的免疫反應，同時轉鐵蛋白靶向性納米顆粒M2 siRNA的傳遞在非人靈長類的研究也顯示其是非常安全的［12］。

Pirollo報道針對腫瘤特異性的抗HER-2 siRNA能夠自我組裝成100 nm左右的免疫復合物(scL)。抗HER-2 siRNA包裹的scL能夠通過沉默靶基因而用于腫瘤細胞的化學治療。這種靶向性沉默在胰腺癌模型中能顯著抑制腫瘤的生長［13］。此外，Tietze應用聚乙烯亞胺衍生物(OEI-HD)改進siRNA多倍體用于體內傳遞RAN siRNA到腫瘤細胞，同時轉鐵蛋白作為靶向性配體結合到多倍體中。轉鐵蛋白結合的OEI-HD/siRNA多倍體能夠在體外特異性的Neuro2A移植瘤模型中降低RAN蛋白的表達。體內RAN蛋白表達的下調能夠增加腫瘤細胞的凋亡，降低腫瘤的生長［14］。

2.4 抗體介導的傳遞

抗體基礎上的ONs靶向性傳遞已經用于腫瘤和白血病的治療中?？贵w具有高的特異性，對靶抗原有較高的親和力，能作為納米顆粒中的靶向性成份。治療性抗體像 trastuzumab(Herceptin)，rituximab(Rituxan)和 alemtuzumab(Campath)已經用于乳腺癌和白血病的臨床治療中［15］?？贵w片段如抗體可變區片段(Fab)和單鏈抗體(scFv)與全抗體相比具有很多優點：分子量更小，同時缺乏恒定區(Fc)，降低抗體在內體傳遞的干擾。已有大量文獻報道能使用單克隆抗體直接傳遞AS-ODNs和siRNA到體內特定的細胞中。Song設計魚精蛋白-抗體的融合蛋白傳遞siRNA到HIV感染的CD4 T細胞中或表達 HIV包膜的 B16黑素瘤細胞中［16］。這些siRNA-抗體-魚精蛋白復合物通過瘤內或靜脈注射能特異性的傳遞siRNA到體內表達HIV包膜的腫瘤細胞內抑制腫瘤的生長。同時他們設計針對人整聯蛋白淋巴細胞功能相關抗原-1的單鏈抗體到抗體-魚精蛋白系統中。這個系統對人白血細胞和激活的粒細胞具有非常好的選擇性，能夠有效的沉默初級淋巴細胞，單核細胞和樹突狀細胞內的相關基因［17］。Wen設計魚精蛋白和針對HBV的抗體融合蛋白進行siRNA的體外、體內的特異性傳遞，顯示siRNA能被靶向性傳遞到HBV感染的細胞和轉基因小鼠中，有效的抑制HBV基因的表達，提高siRNA在HBV治療中的臨床應用［18］。Zhang設計針對AIV血凝素(HA)的抗體魚精蛋白融合蛋白，顯示該融合蛋白在體外能靶向性傳遞siRNA進入AIV感染的細胞，能有效的抑制禽流感病毒的復制［19］。

Peer研究顯示當脂質體結合抗β7整合素的抗體時，體內輸入細胞周期蛋白 D1(cyclin D1，CyD1)的siRNA能夠靶向激活白細胞。siRNA加載脂質體納米顆粒能選擇性的在體內、體外傳遞 Cyclin D1 siRNA到β7陽性細胞中。通過siRNA介導的CyD1基因沉默，在大腸炎小鼠模型中能觀察到白細胞的表達被抑制，顯示CyD1是抗炎癥反應的潛在靶標。其他抗體介導的ONs的傳遞包括針對乳腺癌的抗HER2抗體，針對惡性腫瘤的抗CD19抗體和針對成神經細胞瘤和黑色素瘤的抗GD2抗體［20］。

2.5 肽段介導的傳遞

細胞滲透肽(cell-penetrating peptide，CPP)能夠穿過細胞膜，因此在藥物和核酸的靶向性傳遞中有著重要的作用。細胞滲透肽包括，蛋白轉導區或膜易位序列，一般含短的正電荷肽段序列，大部分具有精氨酸/賴氨酸序列。肽段介導的寡核苷酸傳遞能通過直接結合或連接其他的傳遞系統，如脂質體或多聚物納米顆粒。Chiu連接 Tat肽段(含YGRKKRRQRRR序列)到 siRNA的反義鏈的 3′末端，siRNA-Tat肽段結合物能被細胞快速內化，有效的沉默靶基因［21］。

另一肽段如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginineglycine-aspartic acid，RGD)模式已經被用于靶向整合素受體，該受體在腫瘤脈管系統中激活的內皮細胞表達。Moschos將RGD模式吸附到PEG末端形成分支的聚乙烯亞胺，形成的納米顆粒用于siRNA的體內傳遞［22］。

Kumar通過合成含狂犬病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG-9R)29個氨基酸的嵌合肽，能成功在體內進行siRNA的傳遞。siRNA和帶正電荷的RVG-9R形成的復合物攜帶siRNA進入神經元細胞，靜脈注射后特異性的抑制基因表達。此外還發現RVG-9R/siRNA復合物能很好的保護被致死劑量日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)感染的小鼠［23］。

2.6 適體(aptamer)介導的傳遞

適體已被用于位點特異性的寡核苷酸傳遞，因為它像抗體一樣對靶標具有較高的親和力和特異性，前列腺特異性的膜抗原(prostate-specific membrane antigen，PSMA)是在前列腺癌細胞和腫瘤血管內皮細胞表面過量表達的受體。PSMA的特異性適體能激發特定細胞的攝取并產生RNAi介導的靶mRNA沉默。通過直接將適體和siRNA連接或利用生物素—抗生物素蛋白鏈菌素的親和力進行偶聯實現 RNAi介導的基因沉默［24］。適體與肽段和抗體等其他靶向性配體相比具有很多優點：免疫原性低、易大規模合成、成本低。此外它們能進行多種化學修飾，并且適體(＜15×103)的分子量遠小于抗體(150×103)。

2.7 microRNA介導的傳遞

最近研究人員通過microRNA的方法將溶瘤病毒(oncolytic picornavirus)進行改造用于靶向治療，Kelly將一段與肌肉組織特異的microRNA互補序列插入溶瘤病毒的基因組3′末端，再將該病毒感染患腫瘤小鼠。重組的病毒在皮下組織里具有正常的活性，能引發小鼠的致死性肌炎和病毒血癥。但是，在表達肌肉組織特異microRNA的細胞里，重組病毒無法復制并且不引起致死性的肌炎。同時載體效率高，不產生毒副作用［25］。因此改造的病毒可能成為新的載體系統，用做定向基因治療載體或藥物治療載體。

2.8 無唾液酸糖蛋白受體介導的傳遞

在肝實質細胞上大量表達與無唾液酸糖蛋白(asialoglycoprotein)具有高親和力的表面受體，結合后受體通過內吞作用使蛋白內化可進入細胞內。為了獲得肝實質細胞特異性的基因傳遞，可將半乳糖和陽離子聚合物或陽離子脂質體結合。當前研究已經利用這種方法將基因傳遞到肝細胞，Oishi通過酸不穩定連接構建了聚乙烯-siRNA結合物。在細胞內體弱酸性條件下，這種共價結構被破壞，Lac-PEG-siRNA的共價連接被斷裂，siRNA釋放到HuH-7細胞能夠有效地進行靶基因的沉默［26］。Wu成功的將PLL和非唾液血清類粘蛋白結合用于寡核苷酸到肝細胞的體內傳遞［27］。

2.9 甘露糖受體介導的傳遞

哺乳動物的樹突狀細胞表達甘露糖受體或甘露糖相關受體，巨噬細胞也表達甘露糖受體。靶向巨噬細胞的基因傳遞對Gaucher和HIV疾病的治療是非常有意義的。Kawakami合成新型的甘露糖-膽固醇衍生物(Man-C4-Chol)，在小鼠腹腔巨噬細胞中，Man-C4-Chol脂質體形成的復合物比傳統單獨使用陽離子脂質體轉染顯示出更高的沉默效率［28］。

2.10 其他傳遞系統

Li設計sigma受體靶向性的脂聚陽離子納米顆粒用于體內 siRNA到肺轉移瘤的傳遞［29］?？?EGF受體的siRNA(載體DNA)與魚精蛋白和脂質體形成復合物顆粒，這個顆粒和PEG結合，然后使用茴香酰胺作為配體向肺癌細胞進行靶向性傳遞。茴香酰胺是sigma受體的一個配體。靶向性納米顆粒能夠有效地滲透到肺轉移灶，當靜脈注射siRNA 150 ug/kg復合物時能導致轉移灶模型中70%～80%的基因沉默。最近的研究中，Sato報道維生素A能介導siRNA進入體內星狀細胞，使用這種方法能在星狀細胞內發現特異和顯著的基因沉默，這種沉默能逆轉肝硬化［30］。

3 結論和展望

隨著對人類疾病在分子水平上的更多了解，有效地設計AS-ODN和siRNA能夠干擾特異性的靶標。核酸藥物應用的一個巨大挑戰是體內傳遞到靶細胞的特異性和有效性?；瘜W修飾、納米顆粒包裹和配體偶聯到寡核苷酸都是提高其體內穩定性，藥物代謝動力學和靶特異性非常好的策略。最近的很多研究顯示靶向性傳遞技術可能帶動寡核苷酸藥物治療的進一步發展。

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Targeted Delivery for Oligonucleotide Molecular Therapeutics

ZHANG Tao1，2，WANG Cheng-yu2，ZHANG Wei1，YANG Song-tao2，GAO Yu-wei2，WANG Tie-cheng2，XIA Xian-zhu1，2
(1.Comparative Medicine Centre，Peking Union Medical College(PUMC);Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy Science(CAMS)，Beijing 100021，China;2.Institute of Military Veterinary，AMMS Key laboratory of Jilin province for zoonosis prevention and control，Changchun 130062，China)

Oligonucleotides including antisense oligonucleotides and small interfering RNA can provide for a variety diseases，rapid，specific treatment，with a high potential for application.However，effective delivery of oligonucleotide molecules to specific cells and tissues is critical for finally clinical application.Targeted system can greatly improve the efficiency and specificity of oligonucleotides delivery.Meanwhile，an effective delivery system enable the oligonucleotides to reach the sites of action and access their biological targets.Some delivery strategies based on different platforms and different targeting ligands have been developed，and can play their biological activity.In this paper，the current progress in the field of the study will be summarized.

AS-ODNs;siRNA;Targeted deliver

R342 R332

A

1671-7856(2011)03-0062-05

2010-08-24

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.03.016

(國家科技支撐計劃(NO.2006BAD06A15);農業公益性行業項目(NO.200803014)。

張濤(1981-)，男，博士生，主要從事禽流感的靶向性治療研究。E-mail：zhangtao1012450@163.com。

夏咸柱，教授，E-mail：xia_xzh@yahoo.com.cn。