熒光素酶標的人肝癌細胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發光成像和PET-CT成像比較

李小穎，高 凱，董 偉，張連峰，2

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;2.國家中醫藥局人類疾病動物模型3級實驗室，北京 100021)

熒光素酶標的人肝癌細胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發光成像和PET-CT成像比較

李小穎1，高 凱1，董 偉1，張連峰1，2

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，北京 100021;2.國家中醫藥局人類疾病動物模型3級實驗室，北京 100021)

目的 利用熒光素酶基因標記的人肝癌細胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型，及小鼠肝原位移植模型的生物發光和小動物PET-CT成像的比較。方法 構建表達熒光素酶基因的真核表達載體并將其轉入人肝癌細胞BEL-7402，經梯度濃度G418篩選獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆并擴大培養。BALB/cA-nu裸鼠肝門靜脈接種5×105個發光細胞使其成瘤，活體熒光成像和小動物PET-CT成像系統觀察腫瘤的生長情況。結果 獲得了穩定表達Luc的人肝癌細胞株，將其接種到裸鼠體內，活體熒光成像系統觀察發現能夠成瘤，小動物PET-CT影像觀察發現小鼠肝臟邊緣對18F-FDG有高攝取區域。結論 利用熒光素酶基因標記的人肝癌細胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動物活體成像結合小動物PET-CT技術為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術，為進一步研究肝癌生長轉移機制和藥物開發提供了新的有用工具。

人肝癌細胞;腫瘤模型;熒光素酶;生物發光成像;小動物PET-CT

人肝癌BEL-7402細胞株是1974年從臨床肝癌手術標本中建立的，細胞群體倍增時間為20 h，細胞形態呈上皮樣細胞，在電子顯微鏡下亦顯示上皮細胞所具有的橋粒和張力原纖維，與臨床肝癌細胞相似，分瓶培養第4天時，其有絲分裂指數約為7%。BEL-7402細胞的染色體數為不足三倍體，有一個異常的近端著絲點染色體，間接免疫熒光法測 BEL-7402細胞內的 AFP為陽性反應，LDH同工酶譜顯示與成年人肝細胞不同，而與人胚肝及臨床肝癌相近。目前國內外學者主要集中于不同抗腫瘤藥物體外抗腫瘤作用和機制的研究［1～5］。

本實驗利用螢火蟲熒光素酶基因標記人肝癌細胞BEL-7402，并建立表達熒光素酶的原位肝癌裸鼠模型，利用生物發光成像技術對此模型內的腫瘤生長進行非侵入性的連續監測。同時評價了生物發光成像和小動物PET-CT成像在裸小鼠肝原位移植模型建立中的作用，為肝癌生長轉移機制的研究和藥物開發提供了新的有用工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：人肝癌細胞BEL-7402凍存于本實驗室，L-谷氨酰胺(GIBCO公司)、雙抗(GIBCO公司)、DMEM(GIBCO公司)、胎牛血清(GIBCO公司)、G418(AMRESCO 公司)、脂質體 2000(Invitrogene公司)。活體熒光影像系統(I.C.E.，日本Roper公司)、倒置顯微鏡(Nikon TS100)。18FFDG由中國原子能科學研究院提供。PET成像系統為德國西門子INVEON PET/CT影像系統。PET系統采用64塊LSO(硅酸镥)晶體，PET軸向視野為(FOV)12.7 cm，軸向分辨率距中心1 cm處小于1.7 mm。時間分辨率小于1.5 ns。CT球管電壓為80 kV，球管電流為 400 μA，曝光時間為 300 ms，，CT校描時間約8 min，PET發射掃描10 min，PET重建時使用CT數據進行衰減校正。

1.1.2 實驗動物：BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK(京)2007-0001］，鼠齡5周，體重15～18 g，在本實驗室無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養間飼養。所有實驗操作程序均經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(批準號為GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養基作為BEL-7402細胞的培養液，于5%CO2，37℃細胞培養箱內常規培養。

1.2.2 構建帶有篩選標記的載體：pCAGGS-Neo-Luc由本實驗室構建，用 PCR的方法從質粒pcDNA3.1(+)中擴增neo基因片段，同時在兩端引入酶切位點 XhoⅠ;從質粒 pGL3中用 EcoRⅠ和XbaⅠ切取Luc基因片段，之后分別將neo基因片段和Luc基因片段重組進含有chicken β-actin啟動子的載體pCAGGS中。

1.2.3 細胞轉染和篩選：采用脂質體2 000轉染BEL-7402細胞(具體轉染步驟參照脂質體2 000操作說明)。轉染后24 h，用含 1 000 μg/mL G418的培養液篩選細胞，直至形成肉眼可見的單克隆，挑取單克隆于96孔板，于5%CO2，37℃細胞培養箱內培養，匯合度達70% ～90%后，傳代(1∶2傳代)，取其中一塊96孔板加入適量底物luciferin后進行生物發光檢測，選擇其中高表達的克隆株擴大培養。

1.2.4 裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察：收集處于生長對數期的轉染細胞，稀釋至2×106cells/mL。取250 μL細胞懸液進行肝門靜脈接種，共接種3只。每隔一周觀察一次，連續觀察四周，觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1.5 mg/10 g)，飽和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統攝像，Slide Book 4.0軟件進行分析。

1.2.5 小動物PET-CT影像學觀察：實驗前6 h禁食禁水。將小鼠放入吸氣室內通過吸入混有2%異氟烷的純氧實施麻醉。麻醉完全后，通過尾靜脈彈丸式注射約7.4 MBq(200 μCi)的放射性示蹤劑18FFDG。然后將小鼠俯臥位固定于掃描床，使小鼠頭部長軸和掃描器長軸平行且位于掃描器視野內。18F-FDG攝取45 min后進行10 min PET圖像采集。PET采集完成床板移至CT機架視野中心，進行約8 min的采集。在此過程中通過面罩持續吸入在1 L/min的純氧環境2%異氟烷維持麻醉狀態。

1.2.6 腫瘤組織的病理形態學觀察：腫瘤生長4周后，斷頸處死小鼠并解剖，暴露肝臟，取腫瘤部位制成石蠟切片并進行H-E染色。

2 結果

2.1 穩定高表達Luc的單克隆細胞株

利用chicken β-actin系統表達性強啟動子建立了帶有篩選標記的表達載體pCAGGS-Neo-Luc(圖1A)，將質粒轉染細胞后，形成的單克隆進行成像，成像前10 min，在96孔板內加入用 DMEM配置的底物luciferin(1 mg/mL)20 μL，放入活體熒光影像系統攝像15 min，Slide Book 4.0軟件進行分析(圖1B)。如圖2箭頭所示，選取高表達Luc的克隆株擴大培養并接種裸鼠。

2.2 Luc標記 BEL-7402小鼠肝癌原位腫瘤模型的動態觀察和小動物PET-CT影像學觀察

將對數生長期的Luc標記BEL-7402腫瘤細胞懸液經肝門靜脈接種于3只 BALB/cA-nu小鼠，細胞密度5×105cells/只。分別在接種的 7、14、21和28 d觀察腫瘤的生長情況(封2圖2A～D)。在接種的第7天，就可以觀察到腫瘤發光，第14天時腫瘤的發光強度較第7天時變弱，推測細胞懸液在第14天時才成瘤。14 d后，隨著觀察天數的增加，腫瘤的體積和發光強度增強，且具有很好的線性關系。

腫瘤接種28 d后，經小鼠尾靜脈注入18F-FDG后行 MicroPET-CT顯像，發現小鼠肝臟邊緣有約0.3 cm×1.6 cm帶狀高攝取區域(封2圖2E)。

2.3 腫瘤組織的病理形態學觀察

腫瘤生長4周后，斷頸處死小鼠并解剖，暴露肝臟，發現肝臟上有灰白色的腫瘤組織，表面呈結節狀，質地較硬，獨立或彌漫分布在肝表面和肝邊緣處，部分結節可融合成較大的結節(彩插1圖3A)。

H-E染色肝臟內見多個大小不等腫瘤病灶，腫瘤邊界較清楚，瘤細胞呈巢狀分布，有纖細的纖維組織分隔，腫瘤細胞大小較一致，胞質紅染，核圓形或橢圓形，染色深，核分裂多見(彩插1圖3B)。

3 討論

目前在模型動物體內進行活體成像主要依賴于熒光與生物發光兩種技術。熒光發光需要激發光使得熒光基團達到較高的能量水平，然后發射出較長波長的發射光，但是生物體內很多物質在受到激發光激發后，也會發出熒光，產生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。特別是當發光細胞深藏于組織內部，則需要較高能量的激發光源，也就會產生很強的背景噪音。生物發光成像相對于熒光成像，其靈敏度高。作為體內報告源，生物發光較之熒光的優點之一為不需要激發光的激發，它是以酶和底物的特異作用而發光，且動物體自身不會發光，這樣生物發光具有極低的背景。雖然熒光信號遠遠強于生物發光，但極低的自發光水平使得生物發光的信噪比遠遠高于熒光。生物發光成像技術可以觀測活體模型動物體內腫瘤的生長、轉移及對藥物的反應［6～8］，是研究腫瘤發展及抗腫瘤藥物篩選和評價的新興手段。

正電子發射斷層顯像技術(positron emission tomography，PET)，是利用正電子核素標記的示蹤劑進行活體顯像，能夠無創傷地、動態地、定量地從分子水平觀察活體生理生化變化特點的一種定量顯像技術。是目前最成熟的分子影像技術。小動物PET是基于PET臨床診斷技術發展起來的專門用于小動物的斷層顯像裝置，它具有靈敏度高，可定量以及實驗結果可直接類推至臨床等優點，因而受到了廣大研究者的重視。最新的技術將PET與CT結合起來成為 PET-CT，PET-CT是將PET提供的組織細胞代謝顯像及在受體大分子、蛋白質、核酸基礎上進行的分子影像和CT提供的反映組織解剖結構、血流灌注的顯像有機地結合在一起的最新的影像設備。PET-CT實現了從單一的形態學診斷進到功能與形態相結合的多角度的綜合影像診斷的飛躍，形成一種全新的影像學，解剖-功能影像學。

18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-nuorodeoxyglucose，18F-FDG)是目前臨床上應用最多的腫瘤代謝顯像劑。絕大多數惡性腫瘤細胞具有高代謝特點，葡萄糖為組織細胞能量的主要來源之一，惡性腫瘤細胞的異常增殖需要葡萄糖的過度利用，其途徑是增加葡萄糖膜轉運能力和糖代謝通路中的主要調控酶活性。惡性腫瘤細胞中的葡萄糖轉運信息核糖核酸(mRNA)表達增高，導致葡萄糖轉運蛋白增加。因此，腫瘤細胞內可積聚大量18F-FDG，經PET顯像可顯示腫瘤的部位、形態、大小、數量及腫瘤內的放射性分布。

本實驗利用螢火蟲熒光素酶基因標記人肝癌細胞BEL-7402，獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆，經過多次傳代表達水平穩定，標記細胞的形態、生長方式、生長速度及致瘤能力等與未轉染細胞無明顯差異，可以反映 BEL-7402腫瘤細胞生物學行為的標記細胞，其他標記細胞的研究報道也證實了類似的結果［9］。將其經肝門靜脈接種裸鼠，用活體熒光成像系統連續觀察，發現能夠成瘤，并且腫瘤的體積與發光強度有相關性。同時對此模型進行小動物PET-CT影像學觀察，發現小鼠肝臟邊緣對18F-FDG有約0.3 cm×1.6 cm帶狀高攝取區域。另外解剖學觀察及肝臟組織病理形態學分析，進一步驗證了該方法的可行性。小動物活體成像和小動物PET-CT成像技術對腫瘤動物模型微小病灶的檢測靈敏度極高，能夠進行無創、實時、動態的動物活體觀察，從而對同一實驗對象進行不同時間點的觀察，減少實驗動物個體間差異，與傳統的實驗方法相比，可以大大減少動物的用量，符合替代、減少、優化的“3R”原則，已成為廣泛應用于醫學、生物學及藥物開發等研究領域。小動物活體成像具有比小動物PET-CT成像技術操作簡單，靈敏度高，特異性好，無放射性，價錢便宜等優點。但是小動物活體成像只觀察腫瘤細胞的多少與體積變化，不能實現對精確定位的要求，只要細胞活著就可以觀察到，而不考慮細胞的生存狀態和代謝能力以及活躍程度。小動物PET分辨率較小動物活體成像明顯提高，實現了在活體上非侵入性分子水平顯像，結合小動物CT實現了圖像融合，達到了對精確定位的要求［10，11］。然而18F-FDG是非特異性腫瘤顯像劑，除腫瘤外，正常組織可生理性攝取，一些良性病變也可攝取，容易出現假陽性和假陰性顯像［12，13］，另外有放射性，價錢昂貴。

綜上，利用螢火蟲熒光素酶基因標記的人肝癌細胞 BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動物活體成像結合小動物PET-CT技術為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術，為進一步研究肝癌生長轉移機制和藥物開發提供了新的有用工具。

［1］ 張俊峰，陸敏強，蔡常潔，等.雷帕霉素對人肝癌細胞 BEL-7402體外抗腫瘤作用研究［J］.中國腫瘤臨床，2006，21：1248-1251.

［2］ 張俊峰，陳規劃，陸敏強，等.雷帕霉素誘導人肝癌細胞BEL-7402凋亡中Bcl-2作用研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2006，13(19)：1445-1448.

［3］ 唐潔，梁平，李榮萍，等.脫氧氟尿苷增強順鉑對人肝癌 BEL-7402細胞株的增殖抑制作用［J］.中華普通外科雜志，2007，22(9)：669-671.

［4］ Fan LL，Sun GP，Wei W，et al.Melatonin and doxorubicin synergistically induce cell apoptosis in human hepatoma cell lines［J］.World J Gastroenterol，2010，16(12)：1473-1481.

［5］ Liu H，Qin CY，Han GQ，et al.Mechanism of apoptotic effects induced selectively by ursodeoxycholic acid on human hepatoma cell lines［J］. World J Gastroenterol， 2007，13(11)：1652-1658.

［6］ 孫寶昌，靳寶鋒，侗冬青，等.熒光素酶標記的BEL-7405細胞體內外成像及腫瘤動物模型建立［J］.中國比較醫學雜志，2008，18(1)：1-4.

［7］ 孫萍，王怡，孫志東，等.利用熒光素酶標記的腫瘤細胞建立肝原位移植模型及其活體成像［J］.生物技術通訊，2008，19(3)：383-385.

［8］ Kai T，Min F，Joseph A，et al.Imagable 4T1 model for the study of late stage breast cancer［J］.BMC Cancer，2008，8：228-247.

［9］ 李小穎，高凱，劉學麗，等.人結腸腺癌細胞 HCT-8綠色熒光標記腫瘤模型的建立［J］.中國比較醫學雜志，2009，19(7)：19-22.

［10］ 李天然，田嘉禾.小動物PET及PET-CT及其在分子影像學中的應用［J］.國際放射醫學核醫學雜志，2008，32(1)：1-4.

［11］ Deroose CM，De A，Loening AM，et al.Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined smallanimal PET，small-animal CT and bioluminescence imaging［J］.J Nucl Med，2007，48(2)：295-303.

［12］ 向玲，張永學.腫瘤PET代謝顯像劑及特點［J］.國際放射醫學核醫學雜志，2008，32(3)：133-136.

［13］ 柳曦，周乃康，張錦明，等.18F-FLT在小鼠肺癌和炎癥模型中的生物分布及PET顯像研究［J］.第三軍醫大學學報，2007，29(9)：798-800.

Comparison between Bioluminescent Imaging and Small-animal PET-CT in Xenotransplantation Tumor Model with Luc-expressing Cell

LI Xiao-ying1，GAO Kai1，DONG Wei1，ZHANG Lian-feng1，2
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Model State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To establish hepatic carcinoma mouse model with human BEL-7402 cells expressing luciferase and to compare bioluminescence imaging with that by small-animal PET-CT.Method The vector containing luciferase gene was constructed and transfected into human BEL-7402 liver tumor cell line and selected with G418 to obtain stable Luc-expressing clones.5×105cells，constitutively expressing luciferase，were inoculated to liver of BALB/cA-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system and small-animal PET-CT.Result The stable Luc-expressing BEL-7402 cell lines were abtained，which could grow to tumor mass after implantation.There was high uptake of18F-FDG at the edge of liver with small-animal PET-CT.Conclusion Luc-labeled BEL-7402 cell lines and a mouse tumor model based on the cell lines are established，the whole-body optical imaging system combined with small-animal PET-CT provides a new and reliable technology for the in situ tumor model，which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Human hepatic carcinoma;Tumor model;Luciferase;Bioluminescent imaging;Small-animal PET-CT

R541 R332

A

1671-7856(2011)03-0010-04

2010-06-21

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.003

衛生部項目，實驗動物和人類疾病動物模型資源擴展(200802036)和十一五新藥專項支持(2008ZX09305-001)。

李小穎(1981-)，女，實習研究員。E-mail：lixiaoyinghebei@163.com。

張連峰，E-mail：zhanglf@cnilas.org。