胚胎干細胞移植治療脊髓損傷的研究進展

徐樂勤,丁道芳,李曉鋒,王擁軍,施杞,周重建

胚胎干細胞移植治療脊髓損傷的研究進展

徐樂勤,丁道芳,李曉鋒,王擁軍,施杞,周重建

胚胎干細胞移植具有為損傷的脊髓提供營養,或分化成少突膠質細胞使脫髓鞘的神經再髓鞘化,或分化成神經元并與宿主神經元建立突觸連接等作用,從而修復受損的神經功能,在脊髓損傷的治療中具有良好的應用前景。

胚胎干細胞;脊髓損傷;移植;再生;修復;綜述

脊髓損傷是中樞神經系統的一種嚴重創傷,多由車禍、墜落等造成脊柱脫位、骨折所致。脊髓損傷后,死亡的神經元不能再生,受損部位膠質瘢痕增生,新生的軸突不能通過瘢痕組織,以及損傷部位的慢性脫髓鞘等病理改變[1-2],導致損傷平面以下感覺和運動功能障礙。即使在成人大腦中存在神經干細胞,但其對脊髓損傷的修復能力非常有限,因此脊髓損傷后僅靠機體自身的能力無法修復脊髓功能。隨著神經病理生理及神經發育學研究的不斷深入,細胞移植被廣泛地應用于脊髓損傷的治療。移植的細胞具有替代損傷的神經元、修復損傷的髓鞘、構成新的神經軸突連接,從而達到修復損傷脊髓的作用。目前研究的移植細胞種類有:胚胎干細胞、神經干細胞、間充質干細胞、嗅鞘細胞、施萬細胞等[3]。胚胎干細胞由于其具有無限增殖的能力;廣闊的分化潛能,可分化出無限的、可供選擇的特定細胞類型;同時也能進行基因工程操作,被認為是理想的種子細胞來源。近期研究結果表明,胚胎干細胞或經體外誘導分化形成的神經前體細胞移植到損傷的脊髓,可進一步分化成神經元和神經膠質細胞,使失髓鞘的神經再髓鞘化,從而促進脊髓功能的恢復,提示胚胎干細胞在脊髓損傷的治療中具有良好的應用前景。

1 胚胎干細胞的生物學特性

胚胎干細胞是來源于哺乳動物早期胚胎內細胞團中的一種二倍體細胞,具有長期的未分化增殖能力;在特定的條件下,能夠向內、中、外3個胚層的組織和細胞分化[4-6]。1981年Evans和Kaufman首次從小鼠囊胚中分離、培養得到小鼠胚胎干細胞[7]。此后,人們又相繼采用不同的方法從牛、羊、貓、狗和大鼠等哺乳動物中分離得到胚胎干細胞[8-12]。1998年,Thomson利用體細胞核轉移技術成功地從人類的囊胚分離得到人胚胎干細胞,經體外培養4～5個月后仍能保持未分化狀態,從而建立了人的胚胎干細胞系[13]。這些成果給細胞移植治療、藥物發現及篩選等帶來深遠的影響,為體外培養出更多可供移植選擇的細胞類型奠定了基礎。

胚胎干細胞的主要特性可概括為:①全能性:在體外可誘導產生出3個胚層的分化細胞;在體內能廣泛參與宿主各組織器官的生長、發育,形成嵌合體,特別是生殖系嵌合體;②可修飾性:可在體外進行遺傳修飾,經過遺傳修飾的胚胎干細胞具有攜帶外源基因的特性,同時也能保持發育的全能性;③無限增殖性:胚胎干細胞可保持未分化狀態下的增殖,即使經過長期培養,仍然保持形成3胚層衍生物的能力[14]。正是由于上述特性,胚胎干細胞廣泛應用在細胞發育研究、基因靶向研究、轉基因小鼠疾病模型的制備以及移植治療中樞神經系統疾病的實驗研究。近年的實驗研究結果表明,胚胎干細胞移植能夠促進損傷脊髓功能的恢復,為中樞神經損傷的治療帶來了新希望[15-25]。

2 胚胎干細胞在脊髓損傷再生修復中的應用

脊髓損傷的主要問題在于上、下行傳導神經纖維(軸突)束的斷裂,導致上、下神經元之間形成的神經通路中斷。胚胎干細胞移植具有為損傷的脊髓提供營養,或分化成少突膠質細胞使脫髓鞘的神經再髓鞘化,或分化成神經元并與宿主神經元建立突觸連接等作用,從而修復受損的神經功能。目前,利用胚胎干細胞移植治療脊髓損傷的方法有:未分化的胚胎干細胞直接移植、經誘導分化為神經前體細胞后移植、經基因修飾后移植以及聯合支架或其他細胞共同移植等。

2.1 未分化的胚胎干細胞直接移植 Bottai等將未分化的胚胎干細胞經尾靜脈注射移植治療T8脊髓損傷的小鼠,發現移植28 d后小鼠的運動功能明顯改善。移植胚胎干細胞主要是通過減少巨噬細胞和中性粒細胞的侵入以保護腹側的髓鞘,而對幾種神經營養因子和炎癥因子表達均無明顯影響。雖然在骶髓部位發現了來源于移植的胚胎干細胞的神經細胞(這些細胞呈nestin和β-tubulin陽性)出現了不對稱的克隆,但沒有形成腫瘤[15]。該實驗結果表明,未分化的胚胎干細胞移植后可以通過減少炎性細胞侵入和保護髓鞘免受破壞,從而促進損傷脊髓的修復,提高神經功能。

2.2 胚胎干細胞經誘導分化為神經前體細胞后移植 目前,采用將胚胎干細胞誘導成神經前體細胞后再移植治療脊髓損傷的報道相對較多,主要的考慮是將胚胎干細胞向神經細胞誘導后再移植可以降低腫瘤形成的危險。Liu等采用化學試劑誘導方法建立大鼠脫髓鞘模型,然后將來源于胚胎干細胞的少突膠質前體細胞移植到脊髓后索,檢測胚胎干細胞在脫髓鞘部位的存活、遷移、分化以及形成成熟髓鞘的情況,發現在脫髓鞘部位可以觀察到大量的移植細胞存活,并分化成成熟的少突膠質細胞;將該少突前體細胞移植到先天性髓鞘缺失的成熟小鼠脊髓后,發現移植的細胞不但可遷移且與宿主細胞整合,形成新的髓鞘盤旋圍繞宿主軸索[16]。該實驗結果表明,移植胚胎干細胞來源的少突膠質細胞可以替代損傷脊髓部位缺失的髓鞘。Mc-Donald等將胚胎干細胞誘導分化成的神經前體細胞注射到大鼠脊髓壓迫部位,觀察到移植的細胞在損傷部位存活,分化成星形膠質細胞、少突膠質細胞及神經元,并向受損脊髓的兩端遷移了8 mm[17-18]。該實驗表明了移植外源性的少突膠質細胞可促使中樞神經系統損傷后脫髓鞘的神經纖維髓鞘再生,產生新的郎飛結,使傳導通路部分或全部恢復,對于中樞神經系統損傷的修復具有重要作用。Keirstead等將人胚胎干細胞來源的少突膠質前體細胞移植到成年大鼠脊髓損傷部位,發現移植的細胞可以增加損傷脊髓再髓鞘化,提高運動功能的恢復;并證明早期(損傷后7 d)進行細胞移植具有修復脊髓功能作用,而晚期(損傷后10個月)則沒有修復作用[19]。亦有實驗表明,將人的胚胎干細胞分化成少突膠質前體細胞,然后再移植到損傷的頸髓部位可促進脊髓損傷的修復[20]。以上實驗結果證明了胚胎干細胞來源的少突膠質細胞能與宿主細胞整合,使脫髓鞘的神經再髓鞘化,提示胚胎干細胞分化來的神經前體細胞移植可能是一種有效地治療原發和繼發的成年中樞神經系統脫髓鞘疾病的方法[2,16,21]。

2.3 胚胎干細胞經基因修飾后移植 單純的移植雖然對損傷的脊髓具有一定的修復作用,但仍達不到理想的結果。其主要原因是因為損傷的脊髓微環境不利于移植細胞存活和分化成有利于神經修復的神經細胞。因此,有學者嘗試通過基因修飾的方式來促進移植細胞的存活和分化。如Chen等通過轉染細胞黏附因子L1后,再移植到損傷的脊髓,發現轉染后的胚胎干細胞存活時間明顯多于未轉染的[22]。Hamada等將MASH1基因轉染到胚胎干細胞,促進其在體外向神經前體細胞分化,然后將神經前體細胞移植到損傷的脊髓,結果發現該方法有利于胚胎干細胞向神經細胞分化和軸突的生長,從而改善運動功能[23]。這些結果表明了經基因修飾后的胚胎干細胞更有利于移植治療脊髓損傷。

2.4 胚胎干細胞聯合支架或其他細胞移植 Hatami等將人的胚胎干細胞分化成神經前體細胞,聯合膠原支架移植治療脊髓損傷,結果發現移植后大鼠的后肢運動和感覺功能都得到了提高[24]。Salehi等通過胚胎干細胞聯合嗅鞘細胞移植,結果發現聯合移植在剩余脊髓組織百分率、神經元的分化率以及后肢功能方面明顯優于單純的胚胎干細胞或嗅鞘細胞移植[25]。表明了胚胎干細胞和嗅鞘細胞具有協同促進脊髓修復的作用。這些實驗進一步證明了胚胎干細胞具有促進脊髓功能的恢復,而且聯合治療優于單一的移植治療。

3 問題與展望

上述的結果均證明了胚胎干細胞早期移植治療脊髓損傷是有效的,而且經基因修飾后的胚胎干細胞或者聯合其他細胞或支架移植的效果更好,但這距臨床應用仍有一段距離,其主要的問題有:①胚胎干細胞的定向分化:目前,在體外可采用誘導劑誘導胚胎干細胞定向分化成神經細胞,但這些方案無法用到體內誘導;另外,在體內由于受到脊髓損傷的病理環境影響,胚胎干細胞分化成神經元的比率遠小于體外培養;②胚胎干細胞移植的安全性:雖然目前的實驗結果均未發現胚胎干細胞移植后形成腫瘤,但這些實驗的觀察時間都比較短,而且在移植未分化的胚胎干細胞28 d后骶髓部位形成了不對稱的克隆,表明未分化的胚胎干細胞移植仍然存在成瘤的危險;③移植后胚胎干細胞的存活:損傷的脊髓存在炎癥反應增高、免疫反應,這些病理反應和機體的排斥反應不利于移植細胞的存活。因此,需要進一步研究的主要問題有以下幾方面:①胚胎干細胞或神經前體細胞在損傷脊髓的病理環境下的分化規律,明確不同因子對移植細胞的分化和存活影響情況;②在評價胚胎干細胞移植有效性的同時,需要對移植的細胞進行長期的跟蹤觀察,分析移植細胞的成瘤情況;③探索新的治療方案,因為脊髓損傷后的病理改變復雜多樣,單一的治療手段僅能部分恢復脊髓的功能,而通過不同治療方案的聯合應用可能能更好促進脊髓損傷的修復。

[1]Ronaghi M,Erceg S,Moreno-Manzano V,et al.Challenges of stem cell therapy for spinal cord injury:human embry onic stem cells,endogenous neural stem cells,or induced pluripotent stem cells?[J].Stem Cells,2009,28(1):93-99.

[2]Faulkner J,Keirstead HS.Human embry onic stem cell-derived oligodendrocy te progenitors for the treatment of spinal cord injury[J].T ranspl Immunol,2005,15(2):131-142.

[3]Bareyre FM.Neuronal repair and replacement in spinal cord injury[J].J Neurol Sci,2008,265(1-2):63-72.

[4]Sharma R,Greenhough S,Medine CN,et al.T hree-dimensional culture of human embryonic stem cell derived hepatic endoderm and its role in bioartificial liver construction[J].J Biomed Biotechnol,2010,236147[Epublish ahead].

[5]Boyd NL,Robbins KR,Dhara SK,et al.Human embryonic stem cell-derived mesoderm-like epithelium transitions to mesenchymal progenitor cells[J].Tissue Eng Part A,2009,15(8):1897-1907.

[6]Masaki H,Nishida T,Kitajima S,et al.Developmental pluripotency-associated 4(DPPA4)localized in active chromatin inhibits mouse embryonic stem cell differentiation into a primitive ectoderm lineage[J].J Biol Chem,2007,282(45):33034-33042.

[7]Evans MJ,Kaufman M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

[8]Kubota C,Yamakuchi H,T odo roki J,et al.Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture[J].P roc Natl Acad Sci USA,2000,97(3):990-995.

[9]Campbell KH,McWhir J,Ritchie WA,et al.Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line[J].Nature,1996,380(6569):64-66.

[10]Shin T,Kraemer D,Pryor J,et al.A cat cloned by nuclear transplantation[J].Nature,2002,415(6874):859.

[11]Lee BC,Kim MK,Jang G,et al.Dogs cloned from adult somatic cells[J].Nature,2005,436(7051):641.

[12]Zhou Q,Renard JP,Le Friec G,et al.Generation of fertile cloned rats by regulating oocy te activation[J].Science,2003,302(5648):1179.

[13]Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145-1147.

[14]Srivastava AS,Malhotra R,Sharp J,et al.Potentials of ES cell therapy in neurodegenerative diseases[J].Curr Pharm Des,2008,14(36):3873-3879.

[15]Bottai D,Cigognini D,M adaschi L,et al.Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatory cell infiltration in spinal cord injured mice[J].Exp Neurol,2010,223(2):452-463.

[16]Liu S,Qu Y,Stewart T J,et al.Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(11):6126-6131.

[17]M cDonald JW,Liu XZ,Qu Y,et al.Transplanted embry onic stem cells survive,differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord[J].Nat Med,1999,5(12):1410-1412.

[18]M cDonald JW,Howard MJ.Repairing the damaged spinal cord:a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination[J].Prog Brain Res,2002,137:299-309.

[19]Keirstead HS,Nistor G,Bernal G,et al.Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury[J].J Neurosci,2005,25(19):4694-4705.

[20]Sharp J,Frame J,Siegenthaler M,et al.Human embryonic stem cell-derived olig odendrocyte progenitor cell transplants improve recovery after cervical spinal cord injury[J].Stem Cells,2009,28(1):152-163.

[21]Brustle O,Jones KN,Learish RD,et al.Embryonic stem cell-derived glial precursors:a source of myelinating transplants[J].Science,1999,285(5428):754-756.

[22]Chen J,Bernreuther C,Dihne M,et al.Cell adhesion molecule l1-transfected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2005,22(8):896-906.

[23]Hamada M,Yoshikawa H,Ueda Y,et al.Introduction of the MASH1 gene into mouse embryonic stem cells leads to differentiation of motoneuron precursors lacking Nogo receptor expression that can be applicable for transplantation to spinal cord injury[J].Neurobiol Dis,2006,22(3):509-522.

[24]Hatami M,Mehrjardi NZ,Kiani S,et al.Human embryonic stem cell-derived neural precursor transplants in collagen scaffolds promote recovery in injured rat spinal cord[J].Cytotherapy,2009,11(5):618-630.

[25]Salehi M,Pasbakhsh P,Soleimani M,et al.Repair of spinal cord injury by co-transplantation of embryonic stem cell-derived motor neuron and olfacto ry ensheathing cell[J].Iran Biomed J,2009,13(3):125-135.

Embryonic Stem Cell Transplantation for Spinal Cord Injury(review)

XU Le-qin,DINGDao-fang,LI Xiao-feng,etal.Institute of Spine,Longhua Hospital,ShanghaiUniversity of Chinese Traditional Medicine,Shanghai 200032,China

Transplantation of embryonic stem cells could promote nerve repair by providing nutrients to the injured spinal cord,or differentiating into remyelinating oligodendrocytes or neurons integrating with the host neurons,which has a bright future in the treatment of spinal cord injury.

embryonic stem cell;spinal cord injury;transplantation;regeneration;repair;review

[本文著錄格式]徐樂勤,丁道芳,李曉鋒,等.胚胎干細胞移植治療脊髓損傷的研究進展[J].中國康復理論與實踐,2011,17(1):51—53.

1.上海市教委創新基金(08-YZ56);2.國家自然科學基金面上項目(30973760);3.上海市科委非政府國際合作項目(10410702800)。

上海中醫藥大學附屬龍華醫院,上海中醫藥大學脊柱病研究所,上海市 200032。作者簡介:徐樂勤(1981-),男,福建漳州市人,博士研究生,主要從事中醫藥促進脊髓神經損傷修復研究。通訊作者:周重建。

R651.2

A

1006-9771(2011)01-0051-03

2010-07-27

2010-11-26)

·社區康復·