分子生物學技術在腸致瀉性大腸桿菌診斷中的應用*

陳愛平,陳建輝,楊勁松,林 杰

2.福建醫科大學公共衛生學院教學基地 ,福州 350001

在全國食物中毒事件分析中,微生物類引起的食物中毒事件一直占據著食物中毒原因分類的首位,其中又以細菌性的病原體如副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌和沙門菌等為主[1-2]。2010年我們檢測了兩起群體食源性食物中毒腹瀉病原體以及一起疫苗接種偶合病例的糞便標本,發現可疑病原菌均為腸致瀉性大腸桿菌引起;如果只根據傳統的血清、生化的實驗結果,沒有進一步結合分子生物學技術,這些病原菌就可能被鑒定為普通的大腸桿菌。經文獻檢索發現,目前國內大部份實驗室在腸致瀉性大腸桿菌診斷方面還是以傳統的細菌常規培養、生化、血清鑒定為“金標準”。腸致瀉性大腸桿菌包括腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸出血性大腸桿菌(EHEC)和腸粘附性大腸桿菌(EAEC)五種病原菌。常規的生化鑒定一般只能鑒定到大腸埃希氏菌,而且腸桿菌本身生化表現就相對比較活潑,很難運用生化來區分五種病原菌;血清學診斷在致瀉性大腸桿菌中是起輔助診斷作用,且國產的致瀉性大腸桿菌血清存在血清因子不全,血清交叉凝集等問題,對診斷起了干擾作用。將分子生物學和傳統培養及生化血清兩類鑒定方法有機地統一結合,是提高由致瀉性大腸桿菌引起的食物中毒病原菌檢驗準確率的一個有力的手段。常用的五大致瀉性大腸桿菌常規 PCR檢測特異的診斷基因分別有[3-5]：ETEC(ST-耐熱腸毒素、LT-不耐熱腸毒素),EPEC(eaeA-粘附抺平因子、bf p-束狀菌毛因子),EIEC(virA-質粒毒力基因、ipaH-侵襲性質?？乖?,EHEC(eaeA-粘附抺平因子、stx-志賀樣毒素),EAEC(aggR-粘附聚集因子)。

下面我們對2010年兩起食物中毒事件和一起疫苗接種偶合病例病原菌檢測的案例進行分析,說明分子生物學技術在致瀉性大腸桿菌診斷中的作用。

1 材料與方法

1.1 標本的常規分離培養 按WS271-2007《感染性腹瀉診斷標準》進行培養分離。

1.2 生化鑒定 采用法國生物梅里埃公司生產的API 20E生化鑒定條以及廣東環凱微生物科技技術有限公司生產的生化微量管。

1.3 血清學診斷 采用玻片凝集,診斷血清的生產廠家為寧波天潤,在有效期內使用。

1.4 實時熒光PCR(RT-PCR) 實時熒光診斷試劑盒廠家為上海之江生物科技有限公司,模板DNA的提取及實時熒光PCR的反應體系及擴增程序按照試劑盒使用說明書。

1.5 引物 引物序列依據相應文獻描述[4-7],寡核苷酸由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.6 常規PCR反應條件 PCR反應均采用20 μ L的反應體系,除了特殊說明,各組成成分的終濃度分別為：Ex T aq DNA聚合酶 0.5 U,dNTP 200 μ mol/L,上 游 引 物 0.4 μ mol/L,下 游 引 物 0.4 μ mol/L,DNA 模板 2 μ L 。

1.7 模板的制備 1)直接吸取細菌增菌液1.5mL,13 000r/min離心2min,棄去上清,沉淀下來的細菌加入100μ L的純水制備成菌懸液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min離心5min,取上清作為實時熒光PCR檢測的DNA模板。2)分純的細菌菌落,直接刮取適量于300μ L的純水制備成菌懸液,100℃煮沸裂解10min,10 000r/min離心5min,取上清做為實時熒光PCR及常規PCR檢測的DNA模板。

1.8 試劑儀器 Ex Taq DNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物工程有限公司,瓊脂糖為BioAsia分裝品,電泳儀為北京六一儀器廠生產的DYY-6C型,讀膠儀為上海培清生產的JS-380,PCR擴增儀為GStorm(英國GeneTech公司),實時熒光PCR儀為澳大利亞的Corbett公司生產的Rotor-gene 6000。

1.9 DNA序列的測定及比較 序列測定由上海生工完成,PCR擴增產物進行雙向測序后用DNAS-tar分析軟件進行拼接,校正后的序列在NCBI網站上進行核苷酸的Blast比較。

2 結 果

2.1 案例一

2.1.1 事件概況 2010年11月9日,福州某地幼稚園發生一起疑似食物中毒事件,總共25名學生出現腹痛、腹瀉、發燒、嘔吐等癥狀,年齡在5-6歲之間。11月16日基層CDC將從兩名患兒糞便分離的細菌培養皿送到我們實驗室,其中一名患兒送檢沙門菌顯色平板和大腸桿菌顯色平板各1個,另一名患兒送檢沙門菌顯色平板1個。其中從一名患兒的大腸桿菌顯色平板上檢出侵襲性的大腸埃希氏菌(EIEC)。

2.1.2 分子生物學、生化及血清檢測結果如下 實時熒光PCR檢測顯示侵襲性的大腸埃希氏菌(EIEC)特異的核酸片段陽性。常規PCR檢測結果為EIEC特異的診斷基因(ipaH,virA)陽性。生化實驗表現為API20E生化鑒定條和手工微量生化管鑒定符合大腸埃希氏菌特征。(主要生化表現：葡萄糖⊕、乳糖 +、麥芽糖+、甘露醇 +、蔗糖-、靛基質+、甲基紅+、VP-、枸椽酸鹽-、尿素-、苯丙氨酸-、丙二酸鹽鈉-、水楊素-、氧化酶-、硝酸鹽還原+、鳥氨酸脫羧酶-、精氨酸雙水解酶-、賴氨酸脫羧酶+、硫化氫-、葡萄糖銨+)?，F有的 EIEC診斷血清不能分型。

2.1.3 結合生化及分子生物學的檢測結果判定為EIEC基因陽性的大腸埃希氏菌。

2.2 案例二

2.2.1 事件概況 2010年11月9日漳州某地幼兒園發生一起疑似食物中毒事件。癥狀主要表現為嘔吐、腹瀉,腹瀉次數最高的達10～20次/天;伴有或不伴有發熱、畏寒、頭痛、頭暈、腹痛、肢體抽搐、全身脫水等癥狀。至11月10日凌晨,類似癥狀的患兒逐漸增多,共發現疑似食物中毒病例共50例,其中臨床診斷病例29例。2010年11月15日基層CDC將從三份患兒糞便分離的細菌培養皿送到我們實驗室：患兒1血平皿1個、沙顯培養平皿1個,患兒2麥康凱平皿 1個、患兒3血平皿1個、山梨醇麥康凱平皿1個。其中我們從患兒3血平皿的菌落中檢出致病性的大腸埃希氏菌(EPEC)。

2.2.2 分子生物學、生化及血清檢測結果如下 實時熒光PCR檢測顯示致病性的大腸埃希氏菌(EPEC)特異的核酸片段陽性。常規 PCR檢測EPEC特異的診斷基因(eaeA,bf p)陽性。生化實驗結果表現為API20E生化鑒定條和手工微量生化管鑒定符合大腸埃希氏菌特征(主要生化表現同案例二)?，F有的EPEC診斷血清不能未分型。

2.2.3 結合生化及分子生物學的檢測結果判定為致病性的大腸埃希氏菌(EPEC)。

2.2.4 2010年11月22日基層CDC第二次送檢部分標本,為這起事件中的8份腹瀉患兒的肛拭子的乳糖膽鹽增菌液。肛拭的采樣時間為2010年11月10日,當日增菌后放置于4℃冰箱,2010年11月15日對第一次增菌的增菌液進行二次增菌后放置于4℃冰箱。二次送檢標本的實驗結果如下：實時熒光的檢測顯示8份二次增菌液的DNA提取物中有6份EPEC核酸片段陽性。對二次增菌液的常規分離培養沒有分離到EPEC大腸埃希氏菌。

2.3 案例三

2.3.1 事件概況 2010年10月,我省某地發生一例乙腦疫苗接種偶合死亡病例。該病例為八月大的嬰兒,接種乙腦疫苗4d后死亡。死亡前1～2d無排便、進食差、腹脹明顯、叩診腹部鼓音。臨終前4～5h呻吟、肚子脹明顯,死亡前 1h腹瀉 1次,呈蛋花樣,無嘔吐。從該病例的糞便標本中分離到非典型腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。

2.3.2 分子生物學、生化及血清檢測結果如下 實時熒光PCR檢測從該病例肛拭標本直接提取的DNA結果為EPEC-A基因陽性,而EPEC-B基因陰性。常規PCR檢測從糞便標本中分離純化可疑菌落的aEPEC診斷基因,結果為eaeA陽性、bf p陰性。實時熒光PCR檢測從糞便標本中分離純化可疑病原菌的stx1和stx2基因,結果均為陰性。常規PCR擴增的eaeA基因,進行序列測定后在NCBI上Blast的結果均提示為大腸桿菌O157∶H7、EPEC緊密素(intimin)的eaeA基因。生化實驗結果表現為API20E生化鑒定條和手工微量生化管鑒定符合大腸埃希氏菌特征(主要生化表現同案例二)。現有的EPEC診斷血清不能分型。

2.3.3 綜合分子生物學、序列分析及生化和血清的檢測結果判定為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)。

3 討 論

案例一的事件中,基層CDC采集9名患者肛拭子標本,根據生化特征及致瀉性大腸桿菌血清不凝集的情況,結果只能判定檢出大腸埃希氏菌。目前國產的致瀉性大腸桿菌診斷血清存在著一些問題,包括血清因子不全,血清交叉凝集,血清效價及血清質控等問題,對診斷起了干擾作用;同時由于腸桿菌本身血清、生化表現比較活潑,存在有新的血清型和特殊的生化反應的可能性,根據常規的檢測方法有可能造成致瀉性大腸桿菌的漏檢。由于此次事件中,基層只送檢了兩名患兒糞便分離的細菌培養皿,我們只從1名患兒中檢出 EIEC,無法明確是否由EIEC引起的這起食物中毒。

案例二的疑似食物中毒事件,臨床診斷病例有29例,起先我們收到三個患兒的糞便分離培養物,從一例患兒中分離到EPEC病原菌,對于是否是由于該病原菌引起的食物中毒缺少說服力。實時熒光PCR從第二次送檢的8份增菌液的DNA提取物中,檢出6份EPEC核酸片段陽性,雖然對二次增菌液的常規分離培養我們沒有得到活的EPEC病原菌,但是8份二次增菌液的DNA提取物中有6份顯示EPEC核酸片段陽性,同時結合11月15日送檢的三份患兒糞便分離的細菌培養皿中檢出一份EPEC病原菌陽性,基本上可以斷定這起可疑的食物中毒事件的病原菌是EPEC。考慮二次增菌液已經存放的時間(8d左右)和存放溫度,可能大部份病原菌已經死亡,殘余的活病原菌數量在常規分離培養的檢測限下,造成分離培養的結果為陰性。分子診斷方法在敏感性方面要優于常規的分離培養,特別是實時熒光技術由于多了一條特異的探針,比常規的PCR特異性又相對地提高,是目前各種病原菌應急檢測的首選方案。

案例三從肛拭標本直接提取的DNA進行實時熒光基因檢測,結果為EPEC-A基因陽性、EPEC-B基因為陰性;根據試劑盒提供的判斷標準,提示為不典型的腸致病性大腸桿菌(aEPEC)核酸檢測陽性。我們運用常規PCR擴增分純細菌的eaeA和bf p基因,結果也吻合aEPEC的病原菌特征,即eaeA基因陽性、bf p基因陰性。eaeA序列測定后在NCBI上進行Blast,結果提示該序列是O157∶H7、EPEC的緊密素(intimin)的eaeA基因。同時該病原菌生化鑒定的結果符合大腸埃希氏菌特征,現有典型的EPEC血清群都不能凝聚,綜合以上結果,鑒定該病原菌為aEPEC(未分型)。這與國際上報道的目前大部分的aEPEC血清不能歸于現有典型的EPEC血清型的結果也吻合[8]。在遺傳關系上,aEPEC和腸出血性大腸桿菌(EHEC或STEC)更為密切,但是不含有類志賀毒素stx1和stx2。我們運用實時熒光PCR檢測該stx1和stx2基因的結果也均為陰性。

在這三個案例中,若只依據生化和血清的檢測結果,病原菌都只能鑒定為普通的大腸埃希氏菌,造成錯誤的判定。根據屬地管理原則,食物中毒的病原檢驗任務主要由基層疾控中心承擔,而大多數基層疾控中心沒有條件和技術來開展分子診斷,如常規PCR、實時熒光PCR(RT-PCR)等,仍然主要采用傳統的培養鑒定來完成?；鶎油ǔＪ窃诔醪缴磻洗竽c桿菌特征后,進行血清凝集試驗,根據血清凝集的結果來判定相應的病原群,如果血清不凝集就只能當做腸道的正常菌群大腸埃希氏菌來報告,可能導致腸致瀉性大腸桿菌檢測出現假陰性或者假陽性的情況。

將分子生物學技術和傳統的分離鑒定兩類方法有機地統一結合,是目前提高致瀉性大腸桿菌檢驗準確率的一個有力的手段。目前較普及的分子生物學診斷技術有實時熒光PCR和常規PCR,由于實時熒光PCR敏感性和特異性均較優于常規PCR,且操作簡單耗時短。根據檢測標本種類的不同,本方法既可以做為病原菌初篩的手段指導常規分離培養的方向(主要針對增菌液的DNA提取物),也可以對分純的細菌培養物進行鑒定診斷。常規PCR由于擴增的基因和片段大小比較明確,還可以進行后續的測序分析,通?？梢詫梢煞旨兗毦倪M一步確認實驗。同時,分子診斷技術由于針對的是病原菌核酸片段,即使細菌已經死亡,只要核酸沒有被完全降解,同樣能夠進行檢測;同時由于 RT-PCR的敏感性通常比常規的分離培養要高,當病原菌的數量在常規分離培養的檢出限以下,運用分子診斷方法仍然可以檢測出核酸片段。因此對細菌性病原菌來講將分子生物學診斷手段與常規分離鑒定方法的有機結合,是今后公共衛生事件實驗室調查的一個有力手段。

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