空腸彎曲菌生物膜研究進展＊

張 明，黃金林，焦新安

空腸彎曲菌生物膜研究進展＊

張 明，黃金林，焦新安

空腸彎曲菌是全球范圍內主要的人獸共患性、細菌性腸道病原菌之一［1］，其感染率在世界各地普遍呈上升趨勢，主要引起人體急性腸炎和食物中毒，并伴發反應性關節炎、肝炎、瑞特氏病和格林－巴利綜合征等免疫性損傷性疾病［2］。生物膜是指微生物在生長過程中為適應生存環境而吸附于生物材料或機體腔道表面，分泌黏性胞外基質（extracellular polymeric substance，EPS）將其自身包裹成微菌落，并相互融合形成的高度組織化、系統化的微菌落膜性聚集物［3－4］。生物膜的形成在空腸彎曲菌傳播感染中扮演了重要的角色［5］，因此對于空腸彎曲菌生物膜基礎的研究具有重要的意義。本文對空腸彎曲菌生物膜的形成、相關基因、檢測分析方法、研究展望作了綜述。

1 空腸彎曲菌生物膜的形成

1．1 空腸彎曲菌生物膜的形成條件 空腸彎曲菌是世界范圍內主要的食源性病原菌，與多數腸道細菌類似，在環境中主要以生物膜形式存在。溫度、氧氣、營養條件、吸附材料等環境條件都會影響空腸彎曲菌生物膜的形成［6］。Reeser等［5］定量測定了空腸彎曲菌在不同培養基、不同培養溫度以及不同吸附材料表面生物膜的形成能力，研究表明在37℃條件下培養在MH肉湯中的空腸彎曲菌生物膜形成能力較高，當在培養基中添加葡萄糖、蔗糖、NaCl等都會減弱空腸彎曲菌生物膜的形成；而在不同的材料表面空腸彎曲菌形成生物膜的能力也不同，相對而言其更容易吸附在疏水材料表面形成生物膜。Reuter等［7］發現微需氧性（5%O2，10%CO2）的空腸彎曲菌在高的氧氣濃度下更有利于生物膜的形成。有學者通過研究空腸彎曲菌在可控制的混合微生物環境中的生物膜形成，發現不同的微生物環境能夠影響空腸彎曲菌生物膜的形成，如糞腸球菌和溶血性葡萄球菌能夠聯合空腸彎曲菌在微需氧條件下形成生物膜［8－9］。

1．2 空腸彎曲菌生物膜形成過程 空腸彎曲菌的生物膜形成是一個復雜的過程，也是個動態的過程［10－11］。總體包括粘附、增殖、成熟三個階段。首先，浮游細胞接受環境的營養信號，對宿主表面進行特異性的粘附，其中涉及到一些基因的表達以及蛋白的識別作用［12］，在這個階段單個附著的細胞僅由少量胞外聚合物包裹，研究顯示這些附著的細菌還未進入生物膜的形成過程，很多菌體還可以重新進入浮游生活方式，因而粘附的過程是可逆的［13］。當細菌粘附到表面后，就開始大量繁殖進入增殖階段，在這個階段菌體自身分泌大量的黏性胞外基質［14］，細胞間互相粘附形成微菌落，此時細菌的抗性提高。最后，細菌在粘附表面形成的多個微菌落互相融合，繼續發展，形成彼此間有液體通道相連的成熟的細菌生物膜［15］。而生物膜的形成又是一個循環的過程，成熟生物膜上的一些細菌可以脫落到浮游環境中，又轉變成浮游生長狀態經歷新的循環［16］。

2 空腸彎曲菌生物膜形成過程中的基因調控研究

空腸彎曲菌生物膜的形成過程牽涉到多種基因的表達以及復雜的調控機制，目前對空腸彎曲菌生物膜的研究主要集中在對已知基因進行缺失突變來探索對生物膜形成的影響規律。Asakura等［17］研究了有關細胞間結合蛋白Peb4（CBF2）對空腸彎曲菌生物膜的影響，研究表明Peb4突變株無論是在微需氧還是在有氧條件下，生物膜的形成都有一定程度的減弱。Reeser等［5］研究發現鞭毛在空腸彎曲菌生物膜形成過程中具有重要的作用，其鞭毛突變株與野生菌株相比形成生物膜能力較弱。另外，群體感應調節系統（Quorum sensing）也參與生物膜形成整個過程，細菌通過群體感應信號分子與周圍環境進行交流，從而影響生物膜的形成［18］。研究表明空腸彎曲菌的有關群體感應信號分子基因lux S在空腸彎曲菌生物膜的形成中起到重要的作用，lux S的突變株與野生株比較，生物膜形成能力有較大程度的減弱［19－20］。Fields等［21］研究發現 Csr A 是空腸彎曲菌生物膜形成中的一個催化因子，其csr A突變株只形成了相當于野生株一半的生物膜，而回復株生物膜的形成能力又是野生株的2倍左右。Niou等［22］研究了有關多糖合成的基因gal E對生物膜形成的影響，發現其過量表達會較大程度提高空腸彎曲菌生物膜形成的能力。

3 空腸彎曲菌生物膜的檢測分析方法

近年來隨著對生物膜研究的不斷深入，出現了多種對生物膜的檢測方法，主要包括染色法（剛果紅染色法、銀染法、結晶紫染色法等）和顯微鏡觀察法。實驗中可根據不同的生物膜成分選擇不同的方法來進行檢測，由于目前對空腸彎曲菌生物膜的成分缺乏了解，對其檢測分析就主要包括常規的結晶紫染色法和顯微鏡觀察法。

3．1 結晶紫染色法 利用生物膜內物質對結晶紫染料的結合，可以通過結晶紫染色法對生物膜進行定量檢測。首先，將結晶紫溶液浸潤生物膜形成的表面，靜置一段時間后用水洗除去未結合的染料，然后用乙醇或乙酸溶液溶解附著于生物膜上的染料，最后用分光光度計或酶標儀測定有色溶液的吸光值［23］。Reeser等［5］利用結晶紫染色法對空腸彎曲菌生物膜的形成進行了定量測定，并對不同培養條件進行了比較。

3．2 顯微鏡觀察法 傳統的光學顯微鏡觀察法，樣品制備簡單，易操作。但容易產生折射，生物膜結構損壞嚴重且互相重疊，很難觀察到生物膜的具體結構。掃描電子顯微鏡（SEM）觀察法，樣品需經過梯度脫水，電子束不穿過樣品，僅在樣品表面掃描激發出次級電子而成像，圖像有很強的立體感。但其樣品處理過程中很可能導致樣品變形，以及結構的破壞，僅僅能夠觀察大致的形態學。

激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）觀察法，由于不需要樣品固定和包埋技術，因此不會破壞生物膜的結構，使人們可以在第一時間直接觀察新鮮、完全水合的樣品。除了可以通過圖像軟件得到各個角度的生物膜三維視圖外，更有一些計算軟件可以將三維的圖像數據化，從而使生物膜的特征量化［24］。

4 展 望

空腸彎曲菌是一種重要的人獸共患病原菌，目前其致病機理還不是很明確，而生物膜可能是細菌致病性的一個重要機制。近年來隨著對空腸彎曲菌的研究越來越深入，對空腸彎曲菌生物膜的研究也在不斷發展，空腸彎曲菌生物膜的培養條件、定量測定方法以及一些基因對其的影響也逐漸明了；但目前空腸彎曲菌生物膜的研究只局限于表型的測定和已知基因的缺失突變等，而空腸彎曲菌生物膜基礎表型特征，基因間的調控表達以及形成過程中細胞信號傳導機制等尚未闡明。因此今后空腸彎曲菌生物膜的研究方向應集中于生物膜形成分子調節機制、相關基因之間的表達調控以及一些控制技術領域，對于空腸彎曲菌的傳播感染的控制具有重大的意義。

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R378．99

A

1002－2694（2011）10－0933－02

＊國家自然科學基金（31072150）、國家支撐計劃（2009BADB9B01）

焦新安，Email：jiao＠yzu．edu．cn

揚州大學江蘇省人獸共患病學重點實驗室，揚州 225009

2011－03－29；

2011－06－25