新疆紫草繁育生物學及人工栽培

王升，李璇，2，周良云，林淑芳，吳志剛，郭蘭萍

（1.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；2.西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

新疆紫草繁育生物學及人工栽培

王升1，李璇1，2，周良云1，林淑芳1，吳志剛1，郭蘭萍1

（1.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700；2.西南交通大學生命科學與工程學院，成都 610031）

新疆紫草是我國重要的藥用植物資源，因其臨床療效好、利用價值高，被大量采挖，資源嚴重破壞。本文從繁育生物學的角度出發，通過異型花柱自交不親和、果實種子敗育率高、種子發芽率低、幼苗移栽定植率低四個方面分析了新疆紫草資源短缺的原因，并提出了人工擴大栽培新疆紫草面臨的種源和降低海拔栽培兩大困難和解決困難的方法。

新疆紫草；資源短缺；繁育生物學；人工栽培；種苗快速繁殖；降低海拔栽培

紫草（Arnebiae Radix）是我國的常用中藥材，味甘、咸，性寒，歸心、肝經，具有涼血、活血、解毒透疹等功效。《本草綱目》曰：紫草 “治斑疹、痘毒，活血涼血、利大腸”。《中華人民共和國2010藥典》收錄紫草的主要來源為紫草科（Boraginaceae）新疆紫草[Arnebia euchroma（Royle）Johnst.]或內蒙紫草（Arnebia guttataBunge）的干燥根[1]。

新疆紫草[Arnebia euchroma（Royle）Johnst]是傳統中藥材紫草（Arnebiae Radix）的重要來源。新疆紫草比內蒙紫草的萘醌類有效成分的含量高，臨床療效好，利用價值高[2]。新疆紫草的主要有效成分為紫草素，去氧紫草素，β，β-二甲基丙烯酰紫草素，乙酰紫草素，丙酰紫草素，β-乙酰氧基異戊酰紫草素等萘醌類化合物以及紫草多糖[3，4]。其中的紫草素類萘醌類化合物，具有抑制DNA拓撲異構酶[5]、抗腫瘤[6]、抗 HIV活性、抗血栓、抗生育、抗氧化、鎮靜、抗炎、促進傷口愈合等藥理作用，紫草多糖具有抗病毒活性和免疫調節作用，具有促進機體非特異性免疫和特異性的細胞免疫作用，廣泛應用于醫藥行業[7，8]。另外，紫草素類化合物做為一種天然色素是重要的天然化妝品原料，食品、飲料的天然無毒添加劑，天然印染化工原料等被國際上稱為天然紅色素之王。正是由于新疆紫草具有非常重要的藥用價值和經濟價值，近年來被大量采集，加之過度放牧和生態環境破壞等因素的影響，使本來分布狹窄、數量稀少的新疆紫草野生資源受到了嚴重破壞，導致其野生種類分布區域和數量迅速減少，1996年新疆紫草已經被列為二級保護植物[9]。

為了滿足紫草素的市場需求，細胞組織培養的方法已經成為紫草素生產的重要手段。日本早年就建立了硬紫草的細胞培養體系[10]，我國也建立了特有種——新疆紫草[11]和滇紫草[12]的細胞培養體系，并已利用細胞懸浮體系進行工業化生產紫草素，且細胞系中紫草素的含量遠高于野生原植物根中的含量。這在一定程度上緩解了非藥用紫草素的應用對野生新疆紫草造成的壓力。但是，細胞干粉和紫草素仍不能替代中藥紫草飲片應用于臨床，尤其是新疆紫草在臨床上具有獨特的療效，因此新疆紫草仍面臨巨大的壓力。為滿足藥用需求，人工栽培迫不及待。但是由于存在野生狀態下新疆紫草生境要求嚴格，結籽率低，種子發芽率低，苗期枯萎，幼苗移栽困難等問題，人工栽培面臨著巨大的困難，尚無馴化成功和大面積人工栽培成功報道，只有新疆鶴泊和新疆天牧兩家有限公司曾進行過溫室栽培和人工樣方栽培實驗，目前也只是在進行人工種植的中試放大試驗。新疆紫草資源短缺，種群范圍不斷縮小。本文在分析新疆紫草資源短缺的繁育生物學原因的基礎上，提出了克服栽培過程中存在的困難的策略[13]。

1 新疆紫草繁育生物學分析

長期以來，國內外對紫草科植物的繁育生物學研究主要集中在植物生殖生物學與進化生物學等方面，例如紫草科植物的不同種屬的親緣關系、同種植物的不同花型、花柱二型性、自交不親和特性[14]、選擇性種子敗育[15，16]等方面的研究。而關于新疆紫草則主要集中在繁殖方式、人工種植[17]、長短花柱植株的比例、花的形態特征以及胚胎發育過程等方面。總結新疆紫草資源短缺的繁育生物學原因主要包括異型花柱且自交不親和、果實種子敗育率高、種子發芽率低、幼苗移栽定植率低四個方面。

1.1 異型花柱且自交不親和

異型花柱（heterostyly）是被子植物中一種特殊的花多態現象和雌雄異位形式，包括二型花柱（distyly）和三型花柱（tristyly）2種類型。異型花柱植物的花部特征在避免自交、促進準確的異交傳粉以及通過降低雌雄功能干擾以提高親本適合度等方面具有重要的進化意義[14]。新疆紫草為鐮狀聚傘花序，花柱有明顯的兩型分化現象，為長短二型花柱，種群中有長花柱和短花柱兩種表型，兩花柱類型在自然居群中的比例為1∶1，兩花柱類型強烈的自交不親和性，屬于專性異交的交配方式，相同花型間異交可育，但其結實率（約12%）明顯低于型間異交的結實率（約32%），說明不同花型間花粉與柱頭的組合比相同花型間花粉與柱頭的組合具有更強的親和性和競爭力[18-20]。

對于自交不親和的異型花柱類群，導致二型花柱類群結實率和結籽率低的原因可能有多種，其中由于氣候或者地理區域不同、傳粉者類群變遷導致的花型比例的失衡最為關鍵[14]。長短兩種柱型間居群大小比例的變化，例如居群花型比例嚴重偏離1∶1，無性克隆繁殖和生境片段化能對于異型花柱植物種群中花型比例失衡產生了直接影響。馮建菊、譚敦炎[21]在新疆紫草二型花柱植株結實特性的比較研究中發現3個樣地中長花柱型植株的分枝數、每株花數及結實率均高于短花柱型植株。另外傳粉者的變化和減少，也有可能導致自交不親和的二型花柱類群的結籽率降低，例如當主要傳粉昆蟲由長喙變為短喙的時候，長花柱型花的花粉就不能被有效地轉移到短花柱型花的柱頭上，直接導致短花柱花型被選擇而大量減少。新疆紫草不同花型間花粉與柱頭的組合比相同花型間花粉與柱頭的組合具有更強的親和性和競爭能力[14]。這種現象在藥用牛舌草和牛舌草中已有報道，是由于牛舌草屬含有多等位基因控制的不親和系統，該系統與控制花型的位點不連鎖造成。新疆紫草表現出的這種自交不親和的交配方式的控制機制，還有待于進一步研究。新疆紫草究竟是二等位基因控制的不親和系統還是多等位基因控制的不親和系統有待研究。如果可以找到控制紫草自交不親和的基因系統，并加以修飾，從而解決自交不親和的問題，對于新疆紫草種群的快速恢復是有很大幫助的。

1.2 果實種子敗育率高

果實種子敗育是指幼果或種子在發育過程中不正常或不充分發育，導致不形成果實、種子或者形成不能萌發的種子。新疆紫草的果實為四分小堅果，但是新疆紫草的結籽率很低，大部分果實都敗育或部分敗育，一般一個果實僅有一粒種子能成熟，少有兩粒（＜50%），罕見3粒，4粒都成熟的情況基本上沒有，人工栽培的居群結籽率稍高。野生居群中新疆紫草的結籽率僅10%甚至不到10%[結籽率＝每株結種子數/（每株總花數×4）×100%]。由于新疆紫草在野生條件下形成的種子少，難以收集，所以人工栽培只能挖取野生植株作為栽培的種源，進一步加劇了新疆紫草野生資源的破壞。[19]

植物敗育的原因一般有四（1）雄性不育，包括花藥退化、花粉敗育、絨氈層細胞結構異常等；（2）雌性器官不孕，主要表現為雌性器官形態結構異常、大孢子母細胞及營養器官退化；（3）授粉受精不良，主要表現為自交或異交不親和；（4）胚中途敗育，不同植物胚敗育的時間、敗育原因及解剖學特征各不相同[22]。新疆紫草的繁育系統的研究中進行了花粉敗育率調查和柱頭可授性檢驗。新疆紫草的花粉敗育率為20%～30%，其中長花柱花粉的敗育率顯著大于短花柱花粉的敗育率，長花柱花粉小而多，短花柱花粉少而大。新疆紫草在開花一周內柱頭都具有可授性，尤其在開花的前3 d具有較強的柱頭可授性，另外長花柱柱頭的柱頭可授性顯著高于短花柱柱頭，同時觀察到未得到親和花粉的柱頭可授性比得到親和花粉的柱頭可授性更強。由此可以推斷新疆紫草敗育的主要原因可能是授粉或受精不良和胚中途敗育[20]。

用開花后套袋法檢測，自花后第3 d后依次套袋至花期結束結實率均高于50%，自花開第2 d套袋至花期結束結實率低于50%，但長花柱與短花柱的結實率沒有顯著差異，第2 d結實率低于50%可能是由于昆蟲授粉率較低所致，說明新疆紫草可能存在授粉不良的情況。在新疆紫草花期，中午以后絕大多數是陰雨天，甚至有雪和冰雹，氣溫急劇下降，此時花朵生長停滯，直至天氣轉晴，不利天氣一方面減少了訪花者，另一方面推遲花藥的開裂或影響花粉的生活力，使柱頭在可授期內不能及時接受到花粉，從而影響了傳粉的成功率。地理及氣象因素可能還會影響生境昆蟲區系，從而影響新疆紫草訪花者的種類和數量，昆蟲的訪花行為、訪花頻率和傳粉效果。但是，新疆紫草單花的開放時間以早晨屬多可有效地避免 “洗花”，是新疆紫草在進化過程中形成的對其惡劣生長環境適應的結果。同時，新疆紫草的傳粉昆蟲多在早晨至中午活動，下午以后以及陰雨天很少有昆蟲活動，早晨開花有利于傳粉昆蟲采集和傳遞花粉，也是新疆紫草與其傳粉昆蟲相適應的表現[19，23]。

關于新疆紫草胚發育過程的研究較少，尚不清楚新疆紫草的幼胚在發育過程中是否存在發育障礙，現有的研究推斷新疆紫草部分胚敗育的原因可能是資源限制和配置問題。在同一花序內，距離花序軸越近，結實率和結籽數≥2的花的百分率越高，而不結籽的花百分率越低，這可能是由于越靠近花序軸的花越具有頂花的資源優勢。從植株水平來看，位于低海拔的新疆紫草植株開花時間較高海拔的早，其植株的結實率明顯高于高海拔地區，從而形成更多的果實，這可能是因為較早開的花可以獲得更多的光、熱等資源用于發育果實和種子。從人工栽培和自然居群植株結實格局的比較可見，結兩粒種子的花百分率在很大程度上依賴于資源的有效性，在資源貧乏條件下敗育的胚珠在較高資源條件下有可能發育成熟，即使是資源較高的地方發育成熟的種子也只有1～2粒，幾乎沒有成熟4粒種子的花，說明其種子的敗育格局可能還是部分受遺傳控制[24]。解決這方面的問題應該首先從表面性狀上觀察胚的發育過程，通過電鏡觀察，活力測定等方法觀察從受精到胚發育成熟過程中是哪個步驟出現了發育障礙。可能存在問題的關鍵環節有很多，例如花粉管的萌發或延伸，受精過程障礙，原胚形成、球形胚、心形胚、魚雷形胚或者成熟胚形成過程停止發育，或者胚乳發育不足等等。每個發育過程都有相應的機制，相應的基因控制。對新疆紫草的幼胚的發育過程的觀察研究可以將目標鎖定在某一個發育階段，進而深入到某一組調控基因，從根本上闡述和解決種子敗育的問題。

1.3 種子發芽率低

新疆紫草的繁殖方式有分根繁殖和種子繁殖兩種。由于新疆紫草的藥用部位為根，野生新疆紫草資源被掠奪式采挖的同時又鮮有人工種植，所以實際上新疆紫草的繁育幾乎僅靠種子繁殖，極少通過分根繁殖。種子繁殖過程中種子發芽率則是繁殖力的瓶頸，結籽率高、發芽率高的植物繁殖力則強。

影響種子發芽率的因素主要包括內部因素，種子的完好性、種子胚的活性等和外部因素，光照、水分、溫度、濕度等。新疆紫草種子的發芽率低，內部因素影響很大，即使在最佳溫度、濕度、芽床、浸種處理條件下最高發芽率亦只能達到67.33%，但是在野生條件下由于最佳發芽條件得不到控制，種子的萌發率更低，這也是新疆紫草種群得不到恢復的重要原因[25，26]。適時收集種子，控制種子的發芽條件，提高種子的發芽率，確定播種的最佳時期，進行種子種苗的集中生產等可以較好的解決這方面的問題。新疆紫草種子的完好性和種子的胚的活性的研究比較少，研究主要集中在新疆紫草種子發芽的最佳條件的摸索。李曉君等[25]等通過實驗發現新疆紫草種子萌發適宜溫度為20～30℃，25℃時發芽率最高；清水浸種最佳，最佳浸種時間為24h；50 mg/L的IAA在一定程度上有利于種子萌發；紫草種子發芽率因發芽床而異，砂床較佳，砂間優于砂上。

1.4 幼苗移栽定植率低

幼苗移栽、緩苗到成功定植是新疆紫草種植過程中面臨的一個重要的問題，移栽成活率的提高是擴大栽培的前提。由于當地自然氣候，社會條件等方面的原因，幼苗的移栽擴大種植存在較大的困難。新疆海拔2 000 m以上的區域植物生長季為4～9月份，氣溫在5～10℃之間；7～8月是一年中最熱地表蒸發量最大的月份，平均氣溫18℃；8月底至9月初植物停止生長，全年無絕對無霜期。移栽時間段新疆溫差大，地表蒸發量大，灌溉不成規模等問題是幼苗定植不成功的主要原因。另外，新疆紫草適宜生長的海拔2 000 m以上的區域，耕地面積小，大多為無人區荒漠，給種植過程中勞動者的操作和田間管理帶來較大的困難。

龐克堅等[27]研究不同遮蔭對新疆紫草育苗的影響，發現不同強度的遮蔭處理對原生苗的葉面積、成活率、地下生長量影響顯著。適度遮蔭可以增加葉面積和地下生長量，提高幼苗成活率，30%遮蔭率的遮蔭處理能夠同時滿足增加生長量和提高成活率的要求，同時避免了葉片先端的日灼傷害。龐克堅等[28]還在移栽試驗中發現移栽時間對新疆紫草移栽成活率有極顯著影響，實驗證明從5月中旬至8月初，定植成活率逐漸下降；8月中旬至9月下旬，定植成活率逐漸升高，并在9月下旬達到峰值。在實驗區域，5月初至6月中氣溫和地溫還比較低，蒸發量不大，對新疆紫草的移栽成活率有一定的幫助。6～8月份，溫度雖適宜，但地表蒸發量大，晴天的氣溫較高，常常造成幼苗基生葉的灼傷甚至死亡。進人9月份后，溫度逐漸下降，地表蒸發量降低，有利于移栽成活率的提高。早春或秋季移栽可顯著提高移栽成活率。苗齡對新疆紫草的移栽成活率影響不大，一年生苗在早春或秋季移栽可以同樣達到成活率的要求。依據種植地區的土壤水分條件及蒸發量，適度補給土壤水分可以提高移栽成活率，使土壤相對含水量保持在田間最大持水量的60%～70%，移栽成活率可在80%以上。這些研究都給新疆紫草移栽提供了有力的技術支持。

2 新疆紫草的人工擴大栽培

新疆有很多高海拔的礫石山地，都適宜新疆紫草的生長[29]，充分利用新疆較大面積的、未被利用的高海拔山地優越的光、溫等自然條件，人工大面積種植新疆紫草，不僅能夠合理而持續地利用自然資源，還能取得環境改善與經濟效益的同步發展。

新疆紫草具有野生自然資源極度匱乏、種子繁殖率低、適應生長區海拔較高等特點，在人工擴大栽培過程中，種苗的快速高效獲得和高海拔適生區向低海拔生長區的適應性馴化是實現新疆紫草的GAP生產，制定種植標準操作規程SOP兩大瓶頸問題。

2.1 種苗的快速繁殖

目前在解決藥用植物種苗繁殖問題的主要方式有二，其一是集中采種育苗，其二是利用無性快繁的方式獲得大量的組培苗。

新疆多種藥用植物的種植都是采用采種育苗的方式進行種苗的培育后移栽，目前技術比較成熟的有紅花、甘草、紅景天、雪蓮等。采種育苗的方式主要適應于容易獲得種子的植物的種苗批量繁殖。近年新疆紫草被掠奪式地挖掘，資源日漸枯竭，加之新疆紫草種子繁殖緩慢，生長五年才開花、結果，獲得大量種子十分困難。對于新疆紫草而言種子的來源、種子發芽率、出苗率和幼苗成活率都是采種育苗過程中需解決的難題。龐克堅、王曉東、王玉春[30]應用種子包衣技術提高了新疆紫草育苗的成活率，研究發現新疆紫草種子經包衣處理后能夠顯著提高育苗的成活率有效促進幼苗的生長發育，經以非豆科牧草種衣劑包衣處理后種子的出苗率、保苗率和當年的生長量分別提高14.25%，46.31%和42.02%，在一定程度上解決了新疆紫草育苗的困難。另外，育種過程中注意長短花柱類型新疆紫草的比例，可以提高育種的效率。

組織培養無性快繁技術能夠在短時間內獲得大量的栽培苗，縮短育種周期，解決新疆紫草的種源問題。我國已有通過現代生物技術進行種苗的快速繁殖解決瀕危藥用植物種源的案例，如石斛。石斛是我國珍稀瀕危的藥用植物之一，也曾經面臨過度采挖瀕臨滅絕的境地。石斛具有生態適應性差、生境獨特，種子極其微小，胚具有后熟現象，自然條件下種子難以萌發（一般萌發率低于5%），無性繁殖成活率低、速度慢等生物學特征[31]。近年來，在大批學者的共同努力下，利用無性快繁技術實現了組培種苗的批量化生產，解決了石斛的繁育問題，逐步實現了石斛的大規模人工種植[32]。目前利用無性快速繁殖解決種子種苗的稀缺問題，研究較多的藥用植物還有番紅花、地黃、盾葉薯蕷、半夏、百合等。因此，實現新疆紫草的大面積種植，建立新疆紫草無性快繁體系，解決新疆紫草種苗問題就顯得必要而具有現實意義[33]。新疆大學生命科學與技術學院的計巧玲[34-36]等建立起了新疆紫草無性繁殖系，通過誘導新疆紫草的愈傷組織生成不定芽和誘導細胞懸浮系生成胚狀體發展成為幼苗兩種方式，建立起來的新疆紫草的無性繁殖系穩定可用。新疆紫草的無性快繁雖然已經取得階段性的成功，但是快速繁殖的效率還不能達到規模化的水平，要在新疆紫草生產實際中實現無性快繁還需要進一步的努力。另外，對于組織培養獲得新疆紫草實生苗，還需要解決提高試管苗復壯移栽成活率的問題才能運用到生產實踐中。

2.2 降低海拔栽培

高海拔地區植物生長的環境氣溫、土溫都較低，光照強度大且紫外線強，氧氣稀薄，生育期相對較短。由于高海拔地區大規模種植作物人工管理困難，所以常常需要將高海拔植物引種馴化到相對低海拔種植。從高海拔向低海拔地區引種，氣溫由低到高，紫外線由強到弱，光照強度降低，生育期相應延長。目前，雪蓮、紅景天、川貝母等高海拔藥用植物從高海拔向低海拔地區的引種已經獲得成功[37-39]。降低海拔栽培的首要問題是種子或幼苗的處理，并采取措施縮小引種地和原產地之間的環境條件的差異。

高海拔地區生長的植物在自然狀態下冬天需經歷一個時間相對較長的低溫，經過長時間低溫覆蓋的種子在來年開春后萌發成健康的實生苗。降低海拔栽培后的自然低溫不能滿足種子生理后熟的需要，容易導致實生苗夭折。馬曉匡[39]在川貝母降低海拔的栽培研究中采用了滿胚種子（1～2℃，60 d）低溫處理，模擬高海拔地區冬季的自然低溫完成種子的形態和生理后熟，能夠提高種子的發芽率和實生苗的成活率。新疆紫草在育苗過程中也可以借鑒這種處理方式提高低海拔栽培育苗的成活率。

降低海拔栽培過程中，針對高、低海拔地區氣候不同，可以采取以下措施縮小引種地和原產地之間的環境差異，如遮陰、適時灌水、高畦、畦面覆蓋等措施，降低低溫，保持土壤濕潤，增加散熱，保水、減少地表蒸發[38，39]。

另外，為了克服新疆紫草由高海拔地區到低海拔地區人工種植不易成活的困難，可以選擇性從海拔最低的適生地將新疆紫草向低海拔的種植區引種，以提高引種的成功率。亦可以采用逐步遷徙或進行多代的定向連續培育，在實生苗中選擇適應性最強的植株的種子，再播種、培育、選擇，不斷積累，加強對引種地環境的適應性。

針對新疆紫草進行試管苗無性快繁的情況，可以進行 “試管苗馴化”[40]，即引種馴化工作不在自然狀態下進行，而在可以人工控制的試管中開展。“試管苗馴化”是既能夠實現新疆紫草的定向培育，又能夠縮短育種周期，是適合引種馴化新疆紫草組培實生苗的一種方式。

3 結語

目前，已知了新疆紫草致危的主要繁育生物學原因，但是新疆紫草二型花的形態發生、開花及傳粉生物學特點、結實格局、種子敗育水平與方式、種子萌發特點等與致危原因之間的關系相關理論方面還有待于進一步深入研究。新疆紫草的野生資源呈逐年銳減的趨勢，除了上文分析的繁育生物學方面的原因之外，更重要的是人們對新疆紫草自然資源的過度利用、新疆生態環境的變化如草甸區荒漠化、氣候干旱等。為了保護這一珍稀藥用植物資源，開展遷地保護和人工種植迫在眉睫。從事新疆紫草保護和開發的工作者們，目前工作的重點應該是探究和解決新疆紫草種植過程中面臨的問題，制定出合理的種植標準操作規程SOP，實現新疆紫草的GAP規范化種植，生產出優質道地中藥材，以滿足社會需求，保護日益瀕危的野生資源，維持產區的生態平衡，實現經濟效益、社會效益和生態效益的共贏。

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國家自然科學基金（81130070，81072989），國家中醫藥管理局行業科研專項（201107009），國家科技重大專項（2009ZX09502-026，2009ZX09301-005）；中國中醫科學院課題ZZ20090302.發改辦高技 【2010】1196.

*郭蘭萍，Tel：（010）64011944，E-mail：glp01＠126.com

2011-10-31）