微生物轉(zhuǎn)化在中藥活性成分研究中的應(yīng)用

高寧，程玉鵬，2，畢珊珊，李慧玲，劉莉莉，蔣倩倩，王振月

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150025;3.鶴崗市人民醫(yī)院，黑龍江 鶴崗 154100)

1 微生物轉(zhuǎn)化概述

1864年巴斯德發(fā)現(xiàn)乙酸桿菌能將乙醇氧化為乙酸，開(kāi)啟了人類(lèi)通過(guò)微生物方法合成化學(xué)物質(zhì)的大門(mén)，而20世紀(jì)50年代利用微生物對(duì)甾體化合物的結(jié)構(gòu)改造成為了工業(yè)化微生物轉(zhuǎn)化最重要的里程碑，特別是Murray和Peterson利用黑根霉(Rhizopus nigricans)與紫羅蘭梨頭霉(Tieghemella orchidis)中的羥化酶對(duì)底物的選擇性羥基化反應(yīng)，奠定了生物合成甾體藥物的研究基礎(chǔ)。自20世紀(jì)90年代開(kāi)始，微生物多樣性的研究逐步深入，同時(shí)基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和代謝工程的迅猛發(fā)展，為藥學(xué)工作者提供了大量的、潛在可用的生物催化劑和生物合成途徑，同時(shí)也為生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)化學(xué)品提供了理論基礎(chǔ)。從已有的研究來(lái)看，能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)的微生物種類(lèi)繁多、其所含酶的類(lèi)別多種多樣、反應(yīng)底物結(jié)構(gòu)各異、反應(yīng)類(lèi)型也不盡相同，因此，微生物轉(zhuǎn)化可以挖掘的潛力是巨大的。

微生物轉(zhuǎn)化是指利用微生物細(xì)胞或其所含酶系對(duì)外源化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造而獲得所需要的目的產(chǎn)物的生理生化反應(yīng)。其本質(zhì)就是微生物將作為底物的化合物轉(zhuǎn)化成為產(chǎn)物的過(guò)程，主要涉及羥基化、環(huán)氧化、脫氫、加氫、水解、酯化、脫水、糖基化等各類(lèi)化學(xué)反應(yīng)。微生物培養(yǎng)簡(jiǎn)單、種類(lèi)繁多、酶系豐富，是一種最常見(jiàn)的、有效的生物轉(zhuǎn)化載體，利用微生物整體細(xì)胞或分離酶為反應(yīng)催化劑的生物轉(zhuǎn)化或生物催化技術(shù)，已成為生物轉(zhuǎn)化技術(shù)中發(fā)展最迅速的分支之一，廣泛應(yīng)用于天然化合物的生物合成;前體化合物的生物轉(zhuǎn)化;藥用成分篩選及新藥開(kāi)發(fā)、藥物代謝研究等諸多領(lǐng)域［1］。

2 微生物轉(zhuǎn)化的作用機(jī)理

微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)藥用活性成分主要得益于微生物生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的多種酶及酶系，如纖維素酶、蛋白酶、酯酶等。作為生物催化劑，酶能夠使復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)在常溫常壓下高效快速的完成，微生物轉(zhuǎn)化可以通過(guò)多種方式應(yīng)用于藥用成分的生產(chǎn)中。

首先，微生物所產(chǎn)生的多種酶能夠?qū)λ幱贸煞诌M(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生新的化合物，從而能夠開(kāi)發(fā)出具有新特性的藥用成分;其次，許多微生物生活環(huán)境特殊，能夠產(chǎn)生一些不同于植物的新成分;另外，微生物在與植物相互作用中能夠互相調(diào)節(jié)與影響，并存在一定的物質(zhì)交流與交換，利用微生物轉(zhuǎn)化能夠調(diào)節(jié)藥用植物中各組分的比例，提高目的產(chǎn)物的含量;而且，微生物轉(zhuǎn)化能夠改變部分藥用成分的結(jié)構(gòu)，能夠應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)降解有毒成分，改變藥性、提高藥效。

3 微生物轉(zhuǎn)化在藥用植物活性成分研究方面的應(yīng)用

微生物轉(zhuǎn)化涉及的反應(yīng)多種多樣，且能夠通過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生復(fù)雜的新化合物，因此，人們可以通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化法尋找新的有藥用價(jià)值的衍生物，也可以尋找使這些反應(yīng)發(fā)生的微生物的酶，進(jìn)而用于工業(yè)化生產(chǎn)。近年來(lái)藥學(xué)工作者廣泛開(kāi)展了微生物轉(zhuǎn)化體系的研究，以天然藥物活性成分研究為出發(fā)點(diǎn)，對(duì)甾體類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)和蒽醌類(lèi)等活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的研究并取得了一些成果［2－4］。

3.1 甾體類(lèi)化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究

蟾蜍甾烯(bufadienolides)是一類(lèi)C－17位連接六元不飽和內(nèi)酯環(huán)的甾體化合物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，其有顯著的抗腫瘤作用［5］，但由于此類(lèi)化合物對(duì)人體有一定的毒副作用，同時(shí)，游離型蟾蜍甾烯水溶性也較差，其臨床應(yīng)用受到限制。因此，葉敏等［6］利用微生物體系對(duì)蟾蜍甾烯進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究，獲得了80余個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，其中50余個(gè)為新化合物;發(fā)現(xiàn)了較罕見(jiàn)的在C－7β、C－15及C－16α等位點(diǎn)的羥基取代，并初步探索了蟾蜍甾烯的細(xì)胞毒活性的構(gòu)效關(guān)系。

洋地黃強(qiáng)心苷類(lèi)(digitalis glycosides)是一類(lèi)有強(qiáng)心作用的苷類(lèi)化合物，應(yīng)用于臨床已有200余年的歷史，至今仍是治療充血性心力衰竭的主要藥物之一。利用生物轉(zhuǎn)化的方法對(duì)洋地黃毒苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾已成為研究的熱點(diǎn)［7－9］。王麗娟等［10］選用新月彎孢霉AS3.3589轉(zhuǎn)化洋地黃毒苷得到2個(gè)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率分別為27%和5%;藍(lán)色犁頭霉CICC40302轉(zhuǎn)化洋地黃毒苷得到1個(gè)產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化率為6%。

3.2 萜類(lèi)化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究

雷公藤二萜是衛(wèi)矛科植物雷公藤的主要有效成分，具有免疫抑制、抗炎、抗生育、抗腫瘤等多種生理活性，但其較大的腎毒性限制了雷公藤二萜的臨床應(yīng)用。寧黎麗等利用短刺小克銀漢霉(Cunninghamella blakesleana AS 3.970)對(duì)雷公藤甲素(triptolide)進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到7個(gè)極性都大于底物的產(chǎn)物，其中5α－羥基雷公藤甲素、19α－羥基雷公藤甲素、19β－羥基雷公藤甲素、1β－羥基雷公藤甲素為新化合物［11］;同時(shí)，利用黑曲霉(Aspergillus niger AS 3.739)對(duì)雷公藤內(nèi)酯酮進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，分離并鑒定了4個(gè)產(chǎn)物，其中17－羥基雷公藤內(nèi)酯酮、16－羥基雷公藤內(nèi)酯酮、5α－羥基雷公藤內(nèi)酯酮為新化合物［12］。以上研究為利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)高效低毒的雷公藤二萜衍生物奠定了基礎(chǔ)。

甘草次酸為中藥甘草中的主要成分，具有顯著的中樞性神經(jīng)鎮(zhèn)咳作用和抗炎作用。辛秀蘭［13］等利用多型孢毛霉(Mucor polymorphosporus AS3.3443)對(duì)甘草次酸進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究，分離得到7個(gè)化合物，其中 6β － hydroxyglycyrrhetinic acid、7α － hydroxyglycyrrhetinic acid、3－O －acetyl－7β －h(huán)ydroxyglycyrrhetinic acid、3－oxo－7β －h(huán)ydroxyglycyrrhetinic acid、3－oxo－15α－h(huán)ydroxyglycyrrhetinic acid為新化合物。

3.3 生物堿類(lèi)化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究

喜樹(shù)堿是一種從喜樹(shù)中提取得到的具有較好療效的抗腫瘤藥物，對(duì)胃腸道和頭頸部癌等有較好的近期療效，但對(duì)少數(shù)病人有尿血的副作用;10－羥基喜樹(shù)堿抗癌效果超過(guò)喜樹(shù)堿，而其副作用較小，因此，如何利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將喜樹(shù)堿轉(zhuǎn)化為10－羥基喜樹(shù)堿從而提高后者的含量受到目前許多藥學(xué)工作者的關(guān)注，并取得了較大進(jìn)展。朱關(guān)平［14］采用無(wú)毒黃曲霉菌株T－419(CGMCCO158)，將在喜樹(shù)中含量較高的喜樹(shù)堿轉(zhuǎn)化為10－羥基喜樹(shù)堿，轉(zhuǎn)化率達(dá)50%以上。李麗等［15］利用紫微青霉(Penicillium janthinellum)對(duì)吳茱萸堿的生物轉(zhuǎn)化進(jìn)行了研究，分離并鑒定了2個(gè)化合物。

紫杉醇(paclitaxel)是1971年Wani等從短葉紅豆杉(Taxus brevifolia Nutt.)中分離出的一個(gè)紫杉烷二萜生物堿類(lèi)成分，被認(rèn)為是目前最為有效的抗腫瘤藥物。占紀(jì)勛等［16］利用銅綠假單孢菌(Pseudomonas aerugi-nosa AS1.860)對(duì)紫杉醇進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，并分離出3個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，分別鑒定為baccatinⅢ，baccatin V和10－去乙酰baccatinⅢ，其中產(chǎn)物baccatinⅢ和10－去乙酰baccatinⅢ也是人體代謝的產(chǎn)物。

3.4 黃酮類(lèi)化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究

葛根素是葛根的主要有效成分，但其較低的水溶性使得注射給藥存在較大困難。為提高其水溶性，利用能夠產(chǎn)生麥芽糖淀粉酶的嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearo－thermophilus)對(duì)其進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化，得到α－D－葡萄糖基－(l→6)－葛根素和α－D－麥芽糖基－(l→6)－葛根素兩種主要產(chǎn)物，溶解度分別是葛根素的14 倍和168 倍［17］。

王園 園 等［18］利 用 Streptomyces griseus ATCC 13273對(duì)黃酮類(lèi)化合物柚皮苷，橙皮苷，黃芩苷及木犀草素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，分別得到6個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為柚皮素－7－O－葡萄糖苷，柚皮素，橙皮素，黃芩素，黃芩素－6－甲氧醚和柯伊利素。結(jié)果表明，此轉(zhuǎn)化過(guò)程中涉及到兩類(lèi)反應(yīng)，即糖苷水解和甲基化反應(yīng)，S.griseus產(chǎn)生的L－鼠李糖苷酶對(duì)底物有特異選擇性，β－D－葡萄糖苷酶的選擇性不強(qiáng)，甲基轉(zhuǎn)移酶僅對(duì)黃酮類(lèi)化合物的特異位點(diǎn)進(jìn)行甲基化。

3.5 蒽醌類(lèi)化合物的微生物轉(zhuǎn)化研究

大黃中的蒽醌類(lèi)化合物分為游離型與結(jié)合型，現(xiàn)在已知共計(jì)20余種，如大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，在預(yù)防和治療腫瘤、抗氧化等方面表現(xiàn)出較好的療效。為了進(jìn)一步提高藥效、降低毒副作用，采用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)大黃中游離型蒽醌類(lèi)化合物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾。分別應(yīng)用藍(lán)色梨頭霉(Absidia coerulea)和刺囊毛霉(Mucor coerulea)對(duì)大黃酚、大黃素甲醚、大黃素、蘆薈大黃素分別進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到了7種β－D－吡喃葡萄糖苷衍生物和一個(gè)ω－羥基大黃素［19－20］:其中藍(lán)色梨頭霉的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別為大黃酚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚－8－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黃素－6－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、蘆薈大黃素－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷;刺囊毛霉的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別為大黃酚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚－1－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚－8－O－β－D－吡喃葡萄糖苷、ω－羥基大黃素基。

4 結(jié)語(yǔ)

由于微生物培養(yǎng)簡(jiǎn)單、種類(lèi)繁多、酶系豐富，具有化學(xué)催化劑所沒(méi)有的許多優(yōu)點(diǎn)，因此微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥用植物活性成分研究中的運(yùn)用是中藥生物技術(shù)研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)內(nèi)容。微生物轉(zhuǎn)化可以有效地提高已知的天然活性先導(dǎo)化合物的活性、降低毒副作用、改善水溶性和生物利用度，也可以用來(lái)生產(chǎn)具有重要應(yīng)用價(jià)值的微量天然活性先導(dǎo)化合物，同時(shí)可用于藥物代謝機(jī)制的研究。因此，需要充分利用和發(fā)展新的技術(shù)和方法，加快微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在藥用植物活性化合物研究中的應(yīng)用，獲得結(jié)構(gòu)新穎、藥效良好的新藥，解決人民的健康問(wèn)題。

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