肺癌基因治療現狀與展望

祖玲玲 劉紅雨 綜述 陳軍 周清華 審校

作者單位：300052 天津，天津醫科大學總醫院，天津市肺癌研究所，天津市肺癌轉移與腫瘤微環境實驗室（通訊作者：陳軍，E-mail:huntercj2004@yahoo.com；周清華，E-mail: zhouqh1016@yahoo.com.cn）

肺癌是當今發生率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，根據病理和臨床特征，可以分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）兩大類[1]。其中SCLC約占肺癌發病總數的16.8%，而NSCLC約占80.4%[2]。由于肺癌被診斷發現時往往已屬晚期，導致患者的5年生存率往往低于10%；隨著肺癌診斷和治療技術的進步，目前肺癌的5年生存率可提高到近15%，但距離理想的治療效果還有一定的差距[3]。常規肺癌治療多以手術結合放化療為主，我國還聯合中醫中藥進行綜合治療。由于目前肺癌治療普遍缺乏針對患者的特異性，往往容易產生較強的毒副作用。近年來，隨著腫瘤分子生物學、腫瘤免疫學、生物信息學等學科的迅速發展，使得針對腫瘤的基因診斷、靶向治療、基因治療逐漸成為可能，這也就為肺癌的治療開辟了更加廣闊的前景。

基因治療（gene therapy）是通過分子生物學技術，將目的基因導入患者體內，糾正患者細胞錯誤的基因表達，從而使疾病得以治療，是現代醫學和分子生物學相結合而誕生的新興臨床醫療技術。基因治療主要用于治療危害人類健康的十分嚴重的疾病，包括遺傳病、惡性腫瘤、心血管疾病、感染性疾病等[4]。作為疾病治療的新手段，基因治療已有一些成功的應用，并逐步向主流醫療發展；基因治療作為一種特異性強、靶向性好的新型臨床治療方法，越來越被廣大的肺癌醫學者所重視[5]。隨著基因治療技術的發展以及對肺癌發病機制認識的深入，出開展了越來越多的有關肺癌的基因治療的實驗研究甚至臨床實驗應用。本文將對肺癌的基因治療的目的原則、治療方法、載體選擇進行綜述總結，并展望其可能的前景。

1 肺癌基因治療的目的原則

肺癌的產生是一個多基因參與、逐步發展的復雜過程，其中包括原癌基因的活化、抑癌基因的失活、microRNA表達譜的改變等諸多方面。隨著肺癌基礎研究的開展，尤其是近年來蛋白質組學、轉錄本組學、microRNA表達譜的廣泛應用，使對肺癌的發生和發展過程的了解更加全面深入。目前已經發現，在腫瘤細胞中基因表達具有一定的特點，例如：凋亡抑制蛋白（inhibotor of apoptosis protein, IAP）過量表達[6]、抑癌基因p53的突變或缺失[7]、血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達水平增高[8]、microRNA let-7家族表達水平下調[9]、microRNA miR-17-92表達增加[10]等。基因治療主要直接針對這些基因表達的變化進行設計，通過分子生物學的手段，抑制癌基因、相關細胞因子或microRNA的過度表達，補償抑癌基因或相關microRNA的表達，以達到限制腫瘤生長和轉移的目的，甚至誘導腫瘤細胞發生細胞凋亡，并誘導免疫系統識別清除腫瘤細胞，最終達到對腫瘤細胞的有效殺傷。肺癌基因治療的目的原則包括抑制肺癌細胞的生長、抑制肺癌細胞的轉移和殺死肺癌細胞。

2 肺癌基因治療方法

圍繞上述肺癌基因治療的目的原則，針對肺癌的發生、發展和轉移等各個階段以及治療靶位的不同，基因療法可以概括為以下幾種類型：

2.1 阻礙原癌基因過量表達治療 原癌基因的突變激活是肺癌發生的充分條件，原癌基因或其啟動子的突變可導致原癌基因的高水平表達，最終導致肺癌細胞的永生化和惡性生長。針對原癌基因的異常活化，設計特異的反義RNA或siRNA進行RNA干擾，可以有效地阻礙原癌基因的過量表達。目前常用的RNA干擾的靶基因包括：myc、neu、ras等。目前已報道，將抑制c-Myc基因的miRNA-45表達質粒轉染至ras基因異常表達的NSCLC細胞中，可以抑制NSCLC細胞的生長[11]；myc基因的反義RNA體外實驗可以抑制SCLC細胞的惡性生長[12]。阻礙原癌基因的過量表達治療，可以抑制肺癌的生長和轉移，但不能殺死腫瘤細胞。

2.2 補償抑癌基因表達治療 補償抑癌基因表達治療的方法，是利用分子生物學的技術，將正常的抑癌基因導入腫瘤細胞中，替代原有的突變失活的抑癌基因，或者干擾因抑癌基因的突變造成的信號轉導通路的失調，抑制腫瘤細胞的生長和轉移，進而誘導腫瘤細胞凋亡。目前常用的抑癌基因包括：p53、p16、RB等；其中又以p53基因應用最廣，目前已有針對NSCLC治療攜帶p53基因的重組腺病毒載體的I期臨床實驗[13]，相關的治療效果和毒副作用需進一步的總結。p53基因過表達治療主要針對p53基因缺陷的腫瘤細胞，而對無此突變的細胞無效。抑癌基因表達治療配合放化療，增強腫瘤細胞敏感性的聯合治療，目前已經進入臨床實驗階段[14,15]。

2.3 抗血管生成基因治療 與其它實體腫瘤相同，肺癌是血管依賴性腫瘤，腫瘤血管為腫瘤的生長提供氧氣和養分的輸送和代謝廢物的輸出，此外腫瘤血管通常缺乏平滑肌，基底膜有不規則的漏洞，有利于腫瘤的轉移。抗血管生成基因治療主要通過抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤的生長和轉移。目前抗血管生成基因治療主要包括：針對VEGF及其受體（VEGFR）的基因治療、血管抑素（vasostatin）基因治療、內皮抑素（endostatin）基因治療[16]。其中又以VEGF誘導腫瘤血管生成作用最強、特異性最高，為抗血管生成基因治療的首選[17]。

2.4 自殺基因治療 針對腫瘤治療的自殺基因治療方法，是通過將表達外源性酶活性的基因導入腫瘤細胞，隨后在體內穩定表達的活性酶可以將腫瘤細胞周圍的無毒性的藥物（稱為藥物前體）催化成為僅對腫瘤細胞具有細胞毒性的藥物，從而達到殺死腫瘤細胞的目的[18]。由于在實際應用中，通常采用病毒載體，因此又被稱為病毒介導的酶解藥物前體療法（virus directed enzyme prodrug therapy, VDEPT）。自殺基因治療系統有數十種，其中在肺癌研究中運用最多的是胸腺嘧啶激酶基因/丙氧鳥苷系統（TK/GCV）和胞苷脫氨酶/5-氟胞嘧啶系統（CD/5-FC）。除了針對腫瘤細胞進行治療，目前已經出現應用TK/GCV系統且以腫瘤血管內皮細胞作為靶細胞進行治療的嘗試[19]。但自殺基因治療僅能殺傷S期細胞，自殺基因的靶向導入問題是該療法的主要限制因素。

2.5 免疫基因治療 肺癌細胞的免疫原性弱，一般不足以刺激免疫系統對其產生排斥反應[20]。免疫基因治療就是將特定外源基因轉入腫瘤細胞中，使其高水平表達相關的細胞因子或MHC抗原，從而激化抗腫瘤的特異性免疫作用。使用遺傳工程技術處理腫瘤細胞，使其攜帶特定細胞因子基因，注射至機體后可以在腫瘤位點持續穩定的表達并釋放所攜帶的細胞因子。注射活的攜帶特定細胞因子基因的腫瘤細胞，經過增殖會產生更多的抗原并提高細胞因子濃度，直到達到生物學和藥理學所需的閾值，引起抗腫瘤的特異性免疫反應。隨著免疫反應的進行，腫瘤細胞被殺死，從而關閉了初始的觸發作用[21]。目前研究常用的細胞因子包括：提高IL-2、INF-γ、TNF-α等從而提高機體免疫系統對腫瘤細胞的識別作用，增強組織相容性抗原等位基因表達，誘導機體的免疫反應。免疫基因治療具有結合機體免疫的特點，正逐漸成為肺癌基因治療的研究熱點之一[22]。

3 肺癌基因治療的載體選擇

肺癌基因治療成功的關鍵之一在于外源基因在目的細胞中的高效穩定表達，即基因治療的靶向性、高效性和穩定性，很大程度上取決于基因治療的載體系統。好的基因治療載體具備靶向性、無毒副作用、不引起炎癥反應和免疫反應等優點。目前所使用的載體系統有十余種，從大的方面可以分為病毒載體和非病毒載體兩大類。由于病毒載體較非病毒載體轉移效率高，在實際方案中病毒載體占到85%。另一方面，由于病毒載體在安全性、免疫原性方面的局限性，使得越來越多的新興非病毒載體研究得到發展。下面對肺癌基因治療的主要載體進行小結。

3.1 逆轉錄病毒載體 逆轉錄病毒屬于RNA病毒家族成員，基因組由兩個正義的單鏈RNA分子組成，被衣殼蛋白包裹。整合酶和逆轉錄酶結合于衣殼蛋白上。逆轉錄病毒基因組由兩端長末端重復序列、gag、pol、env四部分組成，其中長末端序列起始雙鏈DNA的合成，gag編碼衣殼蛋白，pol編碼逆轉錄酶和整合酶，env編碼受體識別及衣殼錨定的蛋白。外源目的基因替換gag、pol、env基因后，逆轉錄病毒不能完成自身復制，但可以將攜帶的外源目的基因穩定地整合入靶細胞DNA序列中[23]。針對這一特性，逆轉錄病毒可用于作為基因治療的載體。逆轉錄病毒載體是目前研究最為深入、應用最早、使用最為廣泛的基因治療載體成員之一。逆轉錄病毒載體能夠非常有效地整合進入靶細胞的基因組中，并持續穩定地表達外源基因，同時具有較高的轉導效率。由于逆轉錄病毒載體只能感染增殖細胞，因此比較適于腫瘤的基因治療。目前已有使用逆轉錄病毒載體介導的基因治療案例，通過抑制腫瘤的血管生成抑制腫瘤的生長[24]。但逆轉錄病毒載體存在特異性低、容量較小、病毒滴度較低、不能滿足體積較大腫瘤的治療要求等缺點，使其在腫瘤基因治療中存在一定的局限性。近年來新型靶向性逆轉錄病毒載體及其包裝細胞系的構建逐漸克服了逆轉錄病毒載體特異性低的缺陷[25]，使得逆轉錄病毒載體在腫瘤基因治療中日趨完善。

3.2 腺病毒載體 腺病毒屬于雙鏈DNA病毒成員，基因組有36 kb。依據病毒復制中基因表達的時間順序，腺病毒載體基因組被分成兩個主要部分：早期和晚期。早期表達基因包括四個部分，分別命名為E1、E2、E3、E4。晚期表達基因含有五個編碼單元，分別是L1、L2、L3、L4和L5。敲除E1后腺病毒無法復制，因此無E1的重組腺病毒載體屬于復制缺陷型腺病毒載體[26]。外源目的基因整合到載體E1區域可穩定表達。E3和E4的敲除允許大的外源基因插入載體，并減弱病毒的免疫原性。此外，腺病毒載體同時具備其它的特點，包括：相對于其它病毒載體，轉導效率較高；可以感染分裂和非分裂的細胞；病毒滴度較高；不整合入染色體，安全性較高；持續表達能力不強且表達周期短。應用于肺癌基因治療，由于腺病毒感染具有親肺性，使得腺病毒載體在肺內的轉化效率更高，使其成為肺癌基因治療最常用的病毒載體[14]。目前已研制出多種重組的腺病毒載體，克服了傳統腺病毒載體易激發機體免疫反應的缺點[27]。

3.3 腺病毒相關病毒載體 腺病毒相關病毒載體與腺病毒載體的特性極為相似，優點是可以感染分裂和非分裂的細胞且并不引起免疫反應，轉導效率較高，安全性好，易于基因操作，易制備高滴度病毒，可利用放射線將病毒從潛伏感染進入裂解感染，為基因治療聯合放療創造條件；與腺病毒載體不同的是，腺病毒相關病毒載體能夠將所攜帶的外源基因整合入宿主基因組特異的位置，從而可以長時間穩定地表達外源基因。缺點是載體容量有限，可能會出現免疫排斥反應等。隨著腺病毒相關病毒新型復制模型的發展，將有更多腺病毒相關病毒載體的基因治療應用于肺癌治療[25]。

3.4 細胞轉導肽載體 HIV的Tat蛋白、HSV的VP22蛋白、HBV的前S抗原等蛋白可穿過細胞膜進入細胞，這主要由于該類蛋白中的特殊結構域（一般為10個-30個氨基酸）發揮作用。將這些結構域與其它蛋白、多肽或寡核苷酸等化合物結合或融合表達，可以將生物大分子帶入細胞，這些具有攜帶生物大分子進入細胞的多肽統稱為細胞轉導肽。目前已成功構建利用Tat轉導肽將DNA導入哺乳動物細胞的策略，稱為Tat-Phage系統，實驗性進行基因治療[28]。

3.5 殼聚糖載體 殼聚糖來源于甲殼類動物中甲殼質進行脫乙酰化后得到的多糖物質，屬于天然陽離子聚合物。殼聚糖無毒副作用，具有生物粘附性、生物相容性和可降解性。殼聚糖可以與DNA形成穩定的復合物，抵抗血清的降解作用，進入細胞在體內表達報告基因，但基因表達時間較遲[29]。殼聚糖作為基因治療載體的優勢為安全無毒，故殼聚糖及其衍生物已經開診在肺癌中的基礎研究。

3.6 陽離子脂質體載體 脂質體易于制備，具有較高的生物相容性并可以搭載多種藥物，陽離子脂質體表面帶有正電荷，易于與帶有負電荷的細胞膜相結合，提高轉染效率。實驗表明，陽離子脂質體通過靜脈注射給藥、經皮給藥以及氣管內給藥均可以獲得較高的轉染效率并且明顯集中于肺部。陽離子脂質體介導的mda-7/IL-24基因在體內肺部腫瘤進行實驗性基因治療已經進行[30]。

3.7 納米顆粒載體 納米顆粒載體屬于一種新型的聚合體轉運系統。納米顆粒體積小，更易于將攜帶的目的基因擴散進入細胞。已有基于納米顆粒載體基因治療應用于小鼠癌癥模型實驗證明有較好的抑癌效果。然而，基于納米顆粒的載體基因治療可能受限于載體容量，而小容量的納米顆粒載體可以作為siRNA的有效載體。

4 肺癌基因治療前景展望

肺癌的基因治療總體上還處于起步階段，大部分還處于初創或臨床I期實驗階段，成功應用于臨床尚需大量的工作。目前還存在缺少高效傳遞系統、缺少穩定持續表達以及易產生宿主免疫反應等諸多問題。但有理由相信，隨著基礎研究的深入，將出現更多的、更為有效的基因治療靶位和治療方式；隨著大量臨床實驗的進行，將會出現較為固定和常規的基因治療模式和方法，成為可供醫生選擇的治療手段。由基因治療自身的靶向性好、可操控等特點，可以預見其將有較好的應用前景。同時隨著基因診斷等其它新興技術的臨床應用的普及，將最終實現肺癌患者的基因組水平的個性化診斷。根據診斷結果，將可以實現肺癌的個性化、多靶位的基因治療，完成對患者手術前肺癌的生長轉移控制，術后恢復期的持續治療最終將大大提高肺癌患者的5年存活率。基因治療必將成為肺癌治療的重要工具，最終將造福廣大肺癌患者。