細(xì)胞抽提物重編程作用的研究進(jìn)展

唐新杰 綜述 謝峰 張群 審校

細(xì)胞在發(fā)育過程中，特異性地開放或者關(guān)閉某些特定基因，可以使細(xì)胞產(chǎn)生不同的表觀狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)證明，通過重編程成熟體細(xì)胞的基因形態(tài)可以使其表觀狀態(tài)發(fā)生改變，也就是說分化的體細(xì)胞在特定的條件下能轉(zhuǎn)為另一種細(xì)胞形態(tài)，此過程被稱為體細(xì)胞的重編程。細(xì)胞抽提物誘導(dǎo)是重編程的方法之一，是指用供體細(xì)胞抽提物（Cell extract）作用于受體細(xì)胞后，使受體細(xì)胞表達(dá)供體細(xì)胞的特異性基因。本文就細(xì)胞抽提物重編程的研究現(xiàn)狀、相關(guān)機(jī)理及存在的問題進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞抽提物重編程概述

1.1 細(xì)胞抽提物重編程的方法

重編程的方法有多種，如核移植[1-3]、細(xì)胞融合[4-5]、分子調(diào)控誘導(dǎo)[6-8]以及細(xì)胞抽提物誘導(dǎo)等。經(jīng)典的重編程是將供體細(xì)胞核轉(zhuǎn)入卵細(xì)胞內(nèi)，利用卵細(xì)胞的胞內(nèi)微環(huán)境對供體細(xì)胞基因表達(dá)進(jìn)行重編程，從而使新細(xì)胞獲得全能分化性，著名的克隆實(shí)驗(yàn)就屬于重編程。這種重編程效率極低、有卵細(xì)胞依賴性、涉及倫理問題等，無法廣泛應(yīng)用。細(xì)胞融合是將體細(xì)胞同胚胎干細(xì)胞 （Embryonic stem cell，ESCs）或胚胎生殖細(xì)胞（Embryonic germ cells，EGCs）融合后，使之轉(zhuǎn)化為全能細(xì)胞，但有效率僅為0.1%～0.3%[9]。分子調(diào)控誘導(dǎo)同樣也可對細(xì)胞進(jìn)行重編程，如聯(lián)合應(yīng)用Oct4、Sox2、c-Myc和 Klf4等基因可以誘導(dǎo)體細(xì)胞向多能狀態(tài)分化，染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并表達(dá)多能性基因[6]。

細(xì)胞抽提物重編程的操作方法是一種比較直接的有效方法。與經(jīng)典的重編程不同，首先收集供體細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，然后在脈沖超聲的作用下勻漿，直至顯微鏡下觀察不到細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，離心后的上清液即是供體細(xì)胞的胞漿、胞核抽提物。接下來，用鏈球菌溶血素O（Streptolysin O，SLO）對受體細(xì)胞進(jìn)行滲透化處理，使其胞膜出現(xiàn)可逆性通道。SLO對黏附和非黏附細(xì)胞均具有成孔毒性，處理過的細(xì)胞允許小于100 KDa的分子進(jìn)入細(xì)胞[10]。隨后，在抽提物與受體細(xì)胞的混合物中加入ATP生成系統(tǒng)和合成RNA所需的各種核苷酸NTP后，使抽提物能夠進(jìn)入受體細(xì)胞的細(xì)胞核。最后用含Ca2+的培養(yǎng)液封閉受體細(xì)胞膜通道，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，使其生長、擴(kuò)增，并表達(dá)供體細(xì)胞表型。其中，供體細(xì)胞抽提物的成分包括細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的可溶解成分，不包括染色質(zhì)。

2002年，Hakeline等[12]首次報道應(yīng)用此技術(shù)將T細(xì)胞的抽提物轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)重編程后的成纖維細(xì)胞的組蛋白H4乙酰化，染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并表達(dá)淋巴細(xì)胞特有的基因和表面分子標(biāo)志，在CD3的刺激下，可以合成白細(xì)胞介素2（Interleukin-2，IL-2），這是T細(xì)胞特有的反應(yīng)。同時，報道了應(yīng)用神經(jīng)元前體細(xì)胞的抽提物，成功使成纖維細(xì)胞生長出樹突狀結(jié)構(gòu)，并表達(dá)神經(jīng)纖維蛋白。

1.2 重編程受體細(xì)胞的選擇

目前，受體細(xì)胞主要是成纖維細(xì)胞和成體干細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞在體內(nèi)儲量豐富、取材方便、易于分離培養(yǎng)，而且體外誘導(dǎo)條件下都表現(xiàn)出多向分化潛能，都可以分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞等[13-16]，這為體細(xì)胞重編程后的分化提供了理論支持。最近有研究表明，在特定的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)下，角質(zhì)形成細(xì)胞比成纖維細(xì)胞更容易去分化為多能干細(xì)胞，有效率約為成纖維細(xì)胞的100倍，且角質(zhì)形成細(xì)胞重編程后的細(xì)胞的生長速度是成纖維細(xì)胞的2倍[17]。在抽提物對體細(xì)胞的重編程中，角質(zhì)形成細(xì)胞是否具有同樣的優(yōu)勢，尚待研究證明。

2 細(xì)胞抽提物重編程的作用機(jī)理

細(xì)胞抽提物重編程的機(jī)理尚不明確。目前普遍認(rèn)為是供體細(xì)胞抽提物中的某些物質(zhì)啟動了受體細(xì)胞中某些特異性基因的轉(zhuǎn)錄控制基因[18]，從而使受體細(xì)胞重編程為供體細(xì)胞。Hakelien等[12]認(rèn)為抽提物中的有效成分可能是轉(zhuǎn)錄因子或者DNA結(jié)合蛋白，實(shí)驗(yàn)證明，無論在T淋巴細(xì)胞對成纖維細(xì)胞的重編程，還是在胰島B細(xì)胞抽提物對成纖維細(xì)胞的重編程，均觀察到細(xì)胞核對相應(yīng)IL2基因或Ins基因轉(zhuǎn)錄因子的攝取。而且，熱處理過的抽提物均沒有重編程能力[9，12，18]。

目前的實(shí)驗(yàn)研究中都出現(xiàn)了目的基因啟動子上的組蛋白H3、H4的乙酰化和（或）甲基化狀態(tài)及DNA的甲基化狀態(tài)的改變。細(xì)胞DNA的CpG部位甲基化后可抑制多能性胚胎基因表達(dá)，是促進(jìn)細(xì)胞的分化和生長的必備環(huán)節(jié)，ESCs抽提物處理成纖維細(xì)胞后，80%的CpG部位發(fā)生去甲基化[20]。目的基因啟動子上的組蛋白H3、H4的乙酰化增強(qiáng)和甲基化減弱[9，18-21]，但有研究表明這種改變是暫時的[20]。 眾所周知，RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合至啟動子是轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵。組蛋白結(jié)構(gòu)的變化引起細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而募集RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合至染色體上多能性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)部位，進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄出多種相關(guān)基因。

細(xì)胞抽提物重編程方法表明，分化的細(xì)胞在特定的條件下能分化為另一種細(xì)胞形態(tài)，同時表明細(xì)胞重編程后未必回歸胚胎狀態(tài)，而是能直接賦予細(xì)胞以新的形態(tài)。以往觀察到的轉(zhuǎn)錄因子的改變或者DNA結(jié)合蛋白的改變，可能是重編程的始動因素，也可能是重編程復(fù)雜環(huán)節(jié)中的一環(huán)。目前，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)物質(zhì)（如線粒體等）對細(xì)胞遺傳分化的影響逐漸成為研究熱點(diǎn)[22-25]。體細(xì)胞重編程的始動物質(zhì)、重編程的機(jī)制等問題尚無明確答案。但是，細(xì)胞抽提物的重編程模式已被證實(shí)是一種有效模式，抽提物可以直接進(jìn)入受體細(xì)胞，而且含有重編程所必須的物質(zhì)，在不了解機(jī)理的前提下，仍然可以進(jìn)行高效重編程。

3 細(xì)胞抽提物重編程作用的研究現(xiàn)狀

Gaustad等[19]用大鼠心肌細(xì)胞抽提物處理人脂肪干細(xì)胞，3周后，40%的脂肪干細(xì)胞變成多核細(xì)胞，在培養(yǎng)過程中觀察到細(xì)胞有自動節(jié)律性。同時，部分細(xì)胞表達(dá)α-肌動蛋白、連接蛋白43、肌鈣蛋白等心肌細(xì)胞特有的表面蛋白，并表達(dá)分化細(xì)胞特有的核纖層蛋白A/C（Lamin A/C）。此外，在重編程過程中，處于G1期的細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞的增殖能力減弱。Hakelien等[18]將胰島素瘤INS-1E細(xì)胞提取物轉(zhuǎn)入滲透化處理過的成纖維細(xì)胞,成纖維細(xì)胞變?yōu)閳A形，胞體和核變小。Insulin、Pdx1基因的表達(dá)在培養(yǎng)早期可檢測到，維持7～9 d后表達(dá)減弱直至消失。用胰島素抗體可以檢測到細(xì)胞內(nèi)胰島素蛋白的出現(xiàn)。但在葡萄糖的刺激下，細(xì)胞沒有出現(xiàn)胰島素分泌現(xiàn)象。Bru等[20]用小鼠胚胎干細(xì)胞抽提物轉(zhuǎn)入人293T細(xì)胞。Lamin A/C逐漸消失，1～8 h后表達(dá)干細(xì)胞特有的與多能性相關(guān)的基因 Nanog、Oct4、Sox2、c-Myc 和 Klf4，這些基因的表達(dá)在培養(yǎng)過程中持續(xù)表達(dá)并逐漸加強(qiáng)，說明基因可以發(fā)生長期重編程。培養(yǎng)48 h后這些基因表達(dá)的強(qiáng)度與ESCs相差較多，表明ESCs的抽提物啟動了293T細(xì)胞向多能性狀態(tài)的改變，但是沒有完全分化為ESCs。Rajasingh等[9]將小鼠的ESCs抽提物轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞中，3 d后成纖維細(xì)胞的形態(tài)開始向ESCs變化，10 d時即形成ESCs樣克隆；4周后，重編程的細(xì)胞高效表達(dá) Oct4、Nanog、SSEA1、SCF 和 c-Kit等 ESCs標(biāo)志物，并且在體外誘導(dǎo)條件下，細(xì)胞可以向心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化。將CM-DiI標(biāo)記的重編程后的細(xì)胞應(yīng)用至小鼠下肢缺血模型，術(shù)后7 d、10 d、14 d觀察，缺血下肢的灌注明顯增強(qiáng)，毛細(xì)血管密度顯著增加，移植的細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。應(yīng)用攜帶GFP基因的慢病毒轉(zhuǎn)染重編程的細(xì)胞后，對急性心肌梗死小鼠進(jìn)行心肌注射后發(fā)現(xiàn)心肌纖維化部位明顯減少，左心室無顯著擴(kuò)張，心肌收縮功能較好，梗死部位邊緣組織的毛細(xì)血管密度明顯增加，移植的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。

4 細(xì)胞抽提物重編程目前存在的問題及應(yīng)用前景

4.1 重編程的有效率

根據(jù)文獻(xiàn)說明，細(xì)胞抽提物重編程的最高的有效率為90%[12]，但是在重編程過程中需要連續(xù)更換多種試劑和培養(yǎng)液，這樣就導(dǎo)致增殖細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)，無法準(zhǔn)確估計(jì)重編程細(xì)胞的比例。而且，長期的培養(yǎng)過程使得系統(tǒng)分析與重編程有關(guān)的因子及作用的難度增大。因此，以簡單高效的方法來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞抽提物重編程，是需要進(jìn)一步研究的。

4.2 新基因表型的維持

在抽提物處理細(xì)胞后，8 h內(nèi)即可檢測出目的基因的表達(dá)[20]。目的基因的表達(dá)會在高峰期開始下降。有文獻(xiàn)表明，重編程數(shù)月后還可以檢測到新表型的表達(dá)[11]，新表型的維持時間與受體細(xì)胞的類型和抽提物的來源有關(guān)。如何使重編程后的細(xì)胞最大化且持久地維持新表型，是今后研究的重點(diǎn)方向之一。

4.3 重編程后的細(xì)胞與目的細(xì)胞的差異性

重編程受多種因素的影響，如細(xì)胞所處的環(huán)境變化、周圍組織細(xì)胞分泌的因子的影響、受體細(xì)胞自身的可調(diào)節(jié)性等。目前，尚無證據(jù)表明重編程的細(xì)胞可以分化至與供體細(xì)胞完全相同的形態(tài)，在某些基因的表達(dá)上，兩者存在明顯的差異[20]。所以，需要探索新的實(shí)驗(yàn)方法來調(diào)節(jié)受體細(xì)胞，使其達(dá)到完全轉(zhuǎn)分化或者去分化狀態(tài)。但也有學(xué)者認(rèn)為，重編程無需達(dá)到完全重編程狀態(tài)，只要可以具有需要的功能即可。例如受體細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為胰島B細(xì)胞，只要具有胰島素分泌能力即可，無需完全轉(zhuǎn)分化為胰島B細(xì)胞[27]。

綜上所述，在細(xì)胞抽提物的重編程過程中，細(xì)胞抽提物制備過程簡單，可以通過濃縮達(dá)到一定有效濃度以保存使用。轉(zhuǎn)入到患者自體的受體細(xì)胞內(nèi)，改變患者自體的受體細(xì)胞的表型及功能，使其轉(zhuǎn)變?yōu)橹委熂膊∷枰募?xì)胞，這樣獲得的細(xì)胞可以避免免疫排斥反應(yīng)，且不會造成大的創(chuàng)傷。重編程技術(shù)可以應(yīng)用于多種細(xì)胞，可為組織工程化組織構(gòu)建提供種子細(xì)胞，在組織器官的修復(fù)重建領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V闊的應(yīng)用前景。

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