自體骨髓基質干細胞移植治療糖尿病下肢血管病變

李紅普 仝現州 史帥偉

近年來，糖尿病發病率呈上升趨勢，糖尿病周圍血管病變（Peripheral vascular disease，PVD）也越來越受到關注。PVD主要累及肢體中小動脈，病變廣泛，呈階段性進展，最終造成嚴重的動脈血管狹窄、肢體缺血壞死，截肢（趾）率高，是糖尿病患者致殘的主要原因。PVD患者動脈遠端血管閉塞或狹窄，血液循環差，常規藥物治療效果不明顯；且PVD屬多節段血管病變，多數患者無法進行介入治療或血管搭橋手術。因此，通過細胞移植和基因治療等手段，重新激活或提高機體固有的血管再生能力，從而促進側枝循環的形成，成為治療PVD的新策略。

1 對象與方法

1.1 病例資料

2007年5月至2008年11月，選取雙側下肢病變程度接近的糖尿病周圍血管病變患者30例（60條下肢），其中男18例，女12例，年齡60～78歲（平均69.5歲）。

1.2 操作方法

治療前，控制患者空腹血糖≤7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≤10.0 mmol/L。取得所有患者及家屬的同意并簽署手術治療同意書。

選取患者左下肢作為實驗組，右側為對照組。術前3 d皮下注射人重組粒細胞集落刺激因子500 U/d，共3 d，同時給予低分子肝素預防血栓形成。第4天采集患者雙側髂骨骨髓100～200 mL，淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，制成干細胞混懸液40～50 mL，高倍顯微鏡行有核細胞總數計數，流式細胞儀進行CD34+細胞計數。治療前30 min口服鹽酸美施康定緩釋片10 mg鎮痛，嚴格無菌操作，在實驗側肢體沿動脈走向多點肌肉內注射干細胞混懸液，按2 cm間距進行缺血肢體肌肉注射，每點注射0.5～0.7 mL，進針深度為1.5～2 cm，通常單側下肢注射50～60針。

1.3 療效觀察

治療后觀察15個月，對雙側下肢的膚色、肢體疼痛、冷感、潰瘍、皮溫改變及間歇性跛行進行比較；實驗室檢查：數字減影動脈血管造影 （Digital subtraction arteriography，DSA）和肱踝指數（Ankle brachial pressure index，ABI）等進行治療前后和雙側的對照評估。

1.4 數據統計

采用SPSS 10.0軟件進行分析，實驗側治療前后、對照組一般治療前后采用配對t檢驗，治療組和對照組之間行兩獨立樣本t檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗側治療前后比較

實驗側治療后肢體冷感明顯減輕；疼痛評分明顯低于治療前；間歇性跛行評分明顯降低；無痛性行走距離明顯延長，按正常速度（50～80 m/min）步行，單次行走距離比治療前延長500～2 000 m（表1）。

2.2 實驗側和對照側比較

實驗側肢體冷感明顯減輕，疼痛評分明顯低于對照側，間歇性跛行評分較對照側明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.05）（表 2）。

表2 治療后兩組各項指標治療后比較（s）Table 2 Comparison of the indicators in 2 groups after treatment

表2 治療后兩組各項指標治療后比較（s）Table 2 Comparison of the indicators in 2 groups after treatment

P<0.05

指標 實驗組(s)對照組(s)Indicator Exp group Ctrl group疼痛 1.73±0.96 3.02±0.65 Pain冷感 1.80±1.08 3.07±0.76 Cold sensation間歇性跛行(m)2.33±0.98 3.40±1.20 Claudication(m)皮溫(℃)33.25±0.87 31.50±0.64 Skin temperature(℃)

2.2.1 皮膚顏色和體毛

患肢治療前皮膚顏色暗紅、青紫或蒼白，實驗側經BMSC移植后皮膚顏色逐漸變得光澤、紅潤；下肢水腫也顯著改善；原來下肢或足趾體毛脫落處有新生體毛出現且較前濃密；對照側無上述體征改變。

2.2.2 潰瘍

實驗側治療后，新鮮肉芽組織生長在潰瘍底部，癥狀逐漸減輕。對照組癥狀無顯著改善。

2.2.3 皮溫

實驗側治療后2 d內皮膚溫度逐漸開始升高，并穩定在正常范圍內。而對照側肢體皮溫依然偏低，兩側差異具有統計學意義（P<0.05）。

2.3 DSA

治療后6個月，患者行雙側下肢DSA，實驗側可見豐富的側支血管形成，與治療前相比效果顯著（圖1）。對照組下肢血管造影較治療前無明顯變化。

圖1 治療組治療前后DSA顯示側枝血管生成情況Fig.1 Collateral angiogenesis showed in DSA before and after treatment

2.4 ABI

實驗側治療前ABI為0.35±0.20，治療后ABI為0.56±0.10，P<0.05。對照側治療前后ABI無顯著改變。

2.5 相關并發癥和不良反應

BMSC移植過程中，患者無不適癥狀；移植24 h后可見實驗側肢體輕度腫脹，有脹感，4～8 d后腫脹消失；整個治療過程中，患者均未出現其它異常癥狀及體征，相關輔助檢查肝功能及腎功能無特殊改變，心電圖無異常，凝血酶原時間及血細胞分析正常。

3 討論

PVD是糖尿病發展到中晚期常見的嚴重并發癥之一。PVD主要累及肢體中小動脈，病變廣泛，呈階段性進展，最終造成嚴重的動脈血管狹窄、肢體缺血壞死。近心端病變發生后，由于遠心端血流量減少，血流速度變慢，病程加快，造成嚴重的血管狹窄，遠端微小動脈閉塞，難以進行血管搭橋手術或血管腔內治療，導致肢體遠端嚴重的缺血性壞死，截肢（趾）率甚高，其高位截肢率高達20%以上[1]。部分患者由于心腦血管的疾病，不能耐受手術則會因壞死組織的吸收引發多器官功能衰竭而危及生命。目前，對于這些患者尚無有效的處理措施。因此，治療糖尿病周圍血管病變的新途徑是迫切需要解決的問題。

本世紀初，人們逐漸開始認識到以患者固有的健康血管為基礎，通過某些方法促使血管新生，從而建立豐富的側枝循環是治療PVD等血管閉塞性疾病的最佳策略之一。本組患者的治療結果證實，以BMSC為基礎的細胞移植治療和以血管生長因子為基礎的重組分子藥物治療是達到上述目的的有效途徑，并通過補充間充質細胞的數量來增加血管生長因子的作用底物，從而達到增加血供，改善循環的效果。

既往實驗數據及結果確定，自體BMSC的治療機制主要是通過一系列途徑參與形成了血管新生和微循環的形成；動物實驗證實，自體BMSC植入缺血肢體后可促進局部血管形成[2]。

3.1 自體BMSC的分離

前期研究中我們發現，BMSC可在原始部位進一步分化，然后趨化歸巢至病變部位[3]。因此，對PVD的治療應重視骨髓單個核細胞在缺血部位的組織中原位分化歸巢。我們通過抽取患者骨髓，并在抽取的骨髓血標本中加入淋巴細胞分離液，離心，吸取單個核細胞層進行分離。經過密度梯度離心分離細胞后，雖然淋巴細胞是最后的采集物，但富含干細胞成分的多細胞成分也被濃縮在其中。

3.2 自體BMSC移植

在操作前必須嚴格遵循知情同意原則，與患者及其家屬充分討論獲益與風險評估情況；根據患者的不同情況，分離純化的干細胞可通過在下肢缺血部位的肌肉注射移植。大多數報道認為，干細胞移植應采用蛛網膜下腔阻滯或硬脊膜外腔阻滯麻醉；而我們根據以往的經驗，采用常規肌肉注射，無需特殊麻醉，臨床結果提示治療操作中患者可以耐受并無特殊不適。

Hu等[4]的研究證實，血細胞中可分離純化出內皮祖細胞。因此，我們可以將內皮祖細胞動員至外周血液循環系統中，從而在相對缺血組織中誘導血管新生[5-7]。自體BMSC移植可使大多數患者的局部疼痛得到緩解。另外，PVD患者年齡一般偏大，部分患者既往就有不同程度的心血管及腦血管疾病，并且糖尿病患者本身血液黏滯性較高[8-9]，在移植前后，應根據患者個體情況給予抗凝治療。

3.3 干細胞移植治療的安全性問題

干細胞移植過程中出現的免疫排斥反應、致瘤、致突變作用、感染傳染病以及用粒細胞集落刺激因子行外周血動員過程中可能發生的心臟、腦血管栓塞等意外情況是干細胞移植治療過程中的主要問題。而自體骨髓干細胞移植不存在前3種安全隱患，并可通過抗凝治療來有效預防心腦血管栓塞等意外。谷涌泉等[10]對7例自體BMSC移植后最終卻未能避免截肢者的截肢標本進行了病理學檢查，在局部移植部位肌肉中未見有成骨現象和腫瘤生成征象。孫洪波等[11]對進行自體BMSC移植的15例糖尿病下肢動脈閉塞癥患者術后進行長期隨訪，結果顯示血漿VEGF及TGF-β1水平與動員前無顯著性差異，進一步證明了自體BMSC移植及重組人粒細胞集落刺激因子動員是安全的。張軼斌等[12]觀察行自體BMSC移植患者86例，均行重組人粒細胞集落刺激因子干細胞動員，采集前白細胞數最低為22×109/L,最高為 63×109/L，其中發生心腦血管缺血性并發癥共4例，占4.65%，均為白細胞數上升至40×109/L以上時發生。由此可見，用重組人粒細胞集落刺激因子干細胞動員可出現白細胞增多或血液高凝狀態，二者有可能誘發心絞痛、心肌梗塞、腦梗塞或急性動脈血栓形成，建議在動員過程中酌量使用肝素抗凝。

3.4 自體BMSC移植治療的體會

干細胞治療后患肢的疼痛可以緩解，這顯然同血管的新生沒有關聯，究竟是何原因尚無確切的證據。我們認為，在干細胞肌內注射的過程中，針刺穴位可能是即時止痛的原因，還有待于循證。治療后除非存在肢體潰瘍而引起的壞疽，其余患者即可早日進行適量運動，活動較早較多的患者肢體癥狀緩解較快。結合以往治療經驗分析，其原因可能是因為缺血肢體血供得到了改善[13]，從而改善了骨髓單個核細胞的進一步分化的環境，促進了血管新生。PVD臨床治療是一個綜合性的治療，只有通過全方位治療，并有效地控制感染、監測血糖水平，以達到足部動脈血液供應改善，這是治療的關鍵[14]。自體BMSC移植治療PVD，通過建立側枝循環以達到改善足部動脈血液供應。BMSC移植治療后如何進一步合理處理及結合全面治療使效果達到最優化，有待于進一步探索。

我們對BMSC移植治療PVD進行了初步的臨床嘗試，結果是安全有效的，有望成為一種新的治療方法。對于其中的機理和療效的優化，尚有待于進一步的研究。

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