注射載藥微球表面修飾研究進展

張緒君 ，盧婷利 ，陳 濤 ，2，高迎春 ，趙 雯

近年來，隨著生物技術和基因工程的發展，越來越多的蛋白質、酶有望用于疾病治療。目前已有超過300種蛋白質藥物批準上市或進入臨床研究[1]。然而，由于蛋白質、酶類藥物口服后在腸道中易降解，靜脈注射體內循環時間短、生物半衰期短，大大制約了其應用。為解決這些問題，出現了各種蛋白質類藥物劑型，包括水凝膠、納米球、微球、脂質復合物的脂質體、固體脂質納米粒、油包水型乳劑等。微球以生物可降解聚合物為載體，將生物活性物質固定化后，轉運到特定部位，以預定的速率和劑量發揮作用。與其他緩控釋系統相比，微球具有制備較簡單、穩定性好、成本低等特點，已成為近年來研究的熱點[2]。近年來國內外研究的微球常以聚乳酸 －羥基乙酸共聚物[poly(lactic－co－glycolic acid)，PLGA]為骨架材料，將多肽、蛋白質類藥物包裹或分散于PLGA中制成微球制劑，粒徑范圍一般為1～500μm[3]，給藥后既能達到保護藥物目的，又能隨著聚合物的降解，將藥物以擴散、溶蝕等方式釋放，達到緩釋長效的目的[4]。目前，微球制劑多數為靜脈注射給藥，進入血管內會從血管中迅速清除并被存在于肝、脾及骨髓等處的網狀內皮系統攝取[5]，因此大部分微球藥物不能有效地到達靶向部位，影響了藥物的作用效果。研究表明，延長載藥微球在體內的循環時間，降低微球被網狀內皮系統消除的可能性，有效提高藥物在體內的作用時間，關鍵在于提高載藥微球的靶向性和延長其在靶部位的滯留時間。筆者主要從這兩個方面對PLGA微球給藥系統的研究進展進行介紹。

1 延長微球在體內的循環時間

微球在達到靶部位之前，在體內應該有足夠長的循環時間，網狀內皮系統的攝取對源于網狀內皮系統的疾病治療是有利的，但多數疾病與此系統無關。普通微球經靜脈注射后會被單核吞噬細胞系統吞噬，從血中快速清除并積聚在單核巨噬系統豐盈的組織中，尤其是肝臟和脾被認為是實現藥物靶向輸送到人體器官組織的主要障礙。因此，避免被吞噬系統器官截留以及延長體內存留時間，成為微球制劑的研究熱點。微球的粒徑和表面性質(電荷、親水性等)是影響微球被單核吞噬細胞系統清除的主要因素[5]。因而，控制微球粒徑和改變微球的表面性質是延長藥物在體內循環時間的主要途徑。

1)粒徑因素

粒徑和粒徑分布是微球性質的諸多評價指標中兩項重要的指標，對于微球的包封率和釋放行為有著顯著影響，更是進行微球表面修飾的前提條件。減小微球的粒徑，能增加其在靶部位的聚集，并同時延長其在血液中的半衰期。相同聚乙二醇單甲醚(mPEG，相對分子質量為5 000)修飾微球時，隨著粒徑的減小，巨噬細胞吞噬量減小，大鼠血漿半衰期延長。同時，粒徑范圍也影響到網狀內皮系統的攝取作用，微球粒徑越小，粒徑范圍越窄，越有利于靈活用藥，并能增加生物利用度和降低給藥劑量，提高可控釋性[3]。因此，應根據組織、靶點、循環時間來優化微球的最佳粒徑。同時，還需要選擇合適的包埋方法，如乳化溶劑揮發法、噴霧干燥法、相分離法和乳化交聯法等。但這些傳統的微球制備方法存在著粒徑不均一、粒徑難控的缺點，給實際應用帶來很大困難。

近年來出現了許多新的制備方法，Kluge等[5]應用超臨界液體乳化技術(supercritical fluid extraction of emulsions)，通過改變PLGA濃度與制備初乳階段的攪拌速度獲得的溶菌酶微球平均粒徑在100 nm與幾微米之間，不但分布范圍窄，而且具有重復性與粒徑可控性。Kang等[6]根據文獻報道，改進了超臨界流體技術(supercritical fluid techniques)，采用超臨界流體快速分散溶液技術制備平均粒徑為 1.65 μm(跨度為 0.831)的 PLLA/PLGA空白微球，和平均粒徑為2.35μm(跨度為0.914)的吲哚美辛－PLLA/PLGA微球。

2)微球表面修飾

使微粒長循環和靶向性的主要方法是表面修飾，如非離子表面活性劑包衣和聚乙二醇修飾。巨噬細胞消除外來粒子的一個主要機制是通過識別結合于微粒上的免疫球蛋白G(IgG)的Fc段和補體，來吞噬抗體結合的微粒。將微球表面修飾上親水基團，可以改變微球表面的疏水性，同時利用位于表面的聚合物鏈的空間效應，減少血漿蛋白在微球表面的吸附，避開肝巨噬細胞尤其是枯否細胞(Kupffer cell)的識別和吞噬，延長在血液中的循環時間。PLGA因具有優良的生物相容性及可降解性而在醫用生物材料中得到了廣泛應用，然而由于其表面缺乏細胞識別位點，以及存在親水性和細胞親和性不足等缺點，影響了細胞在其表面的黏附生長。為了得到生物功能和親水性均較理想的PLGA，通常應用物理或者化學的方法在材料中引入其他分子對其進行改性，賦予材料生物信號，以提高其適用性。

(1)聚乙二醇共價偶聯修飾

共價偶聯修飾是將表面修飾物質與載體材料通過一定的化學反應鍵合，然后制備微粒。作為外源異物的微球被巨噬細胞吞噬，始于內源蛋白與微球的非特異性結合。將聚乙二醇等親水性聚合物通過酯鍵共價連接到微粒載體上，可得到較穩定的包衣層。最常見的聚乙二醇是線性或分支的，末端帶有的羥基具有伯醇性質，能進行酯化和醚化反應[7]。將聚乙二醇長鏈與PLGA共價結合，增加聚乙二醇分子量可使納米粒與單核吞噬細胞系統相互作用減弱，循環時間更長[8]。經聚乙二醇修飾的共聚物納米粒，由于聚乙二醇在納米粒表面形成聚乙二醇束起到空間位阻作用，與未經修飾的相比，可降低血液中調理素蛋白在納米粒表面的吸附等作用，阻斷或延遲單核吞噬系統對納米粒的識別吞噬，延長藥物在循環系統的滯留時間，改變其在在血液和肝、脾等單核細胞豐富的器官中的分布[9－10]。

聚乙二醇是親水、非離子性的高聚物，具有良好的生物兼容性，是目前避免單核吞噬細胞系統清除作用和延長脂質體在血液中駐留時間的最常用試劑。聚乙二醇嫁接在蛋白質、肽以及非肽類分子上，具有無毒、無免疫性、不產生抗原和水中穩定等優點，并已通過美國食品藥物管理局(FDA)認證。聚乙二醇分子可以通過多種途徑被引入納米粒，如在納米粒制備過程中通過共價鍵鍵合(即化學嫁接技術)或者利用納米粒的表面吸附作用結合等[7]。修飾后的藥物或載藥微粒具有滯留時間長、降解作用弱、免疫可能性低等優點。聚乙二醇修飾使多肽、蛋白質類藥物得到了較廣泛的應用。

除了能延長在體循環中的駐留時間外，納米粒表面的聚乙二醇還能夠起到其他作用，例如減少蛋白質和酶在其表面的吸附，從而減緩PLGA的生物降解速度。通過改變聚乙二醇的密度和相對分子質量，可以控制表面吸附的蛋白質量處于最小值。采用聚乙二醇改性后，聚乳酸納米粒在模擬胃液中的穩定性增加。采用模擬胃液處理4 h后，9%聚乳酸納米粒轉化為乳酸鹽，但改性后的聚乳酸納米粒只有3%的轉化率。

全靈東等[11]以PLGA經mPEG修飾后的三嵌段共聚物mPEGPLGA－mPEG(PELGE)制備靜脈注射用胰島素納米粒，聚乙二醇含量為5% ～10%時，包封率達到了94% ～98%，載藥量為4.48% ～4.67%。對納米粒進行聚乙二醇修飾后，改變了聚合物表面的親水性和柔順性，形成親水嵌段外殼而不被網狀內皮系統攝取與肝、脾、肺快速清除，延長了胰島素在血液循環中的停留時間。

在PLGA分子中，可同時引入氨基酸和聚乙二醇。為從分子結構上改善PLGA材料的親水性和細胞黏附性，羅丙紅等[12]以辛酸亞錫為催化劑、聚(聚乙二醇 －co－L－天冬氨酸)交替預聚物(PEG－ASP)n引發劑引發 D，L－丙交酯和乙交酯開環共聚，合成帶有功能側氨基的PLGA－(PEG－ASP)n共聚物，通過細胞黏附試驗比較，該共聚物的親水性以及對骨髓基質細胞的黏附能力和黏附效率均明顯優于未修飾的PLGA，有望成為一種良好的可降解吸收組織工程支架材料以及骨靶向藥物緩釋載體。

(2)表面活性劑表面吸附修飾

通過物理吸附的原理，將某些表面活性劑吸附到納米粒表面也可達到長循環的目的。主要采用非離子型聚氧乙烯類表面活性劑，最常用的是泊洛沙姆及其乙二胺衍生物。非離子表面活性劑包衣納米粒長循環的機制是，不帶電荷、親水性表面的包衣層以及聚合物的立體排阻效應阻斷了納米粒與巨噬細胞的吞噬過程[13－14]。親水性的包衣能減少納米粒對血中成分的吸附(如opsonin，apolipoprotein)，從而降低血漿蛋白的調理作用。表面活性劑吸附層厚度增加，吞噬細胞的吞噬功能則下降，一般認為表面層的厚度大于10 nm，能有效發揮空間位阻作用。

王杰等[15]用3H－環孢菌素A制備了平均粒徑為59 nm的聚乳酸納米粒，采用物理吸附的方法分別用Brij 78，Myrj 53，Myrj 59作表面活性劑對其進行了表面修飾。以小鼠腹腔巨噬細胞為體外細胞模型，以一級昆明種小鼠為動物模型，分別進行體外細胞吞噬試驗和體內組織分布試驗。用泊洛沙姆407和泊洛沙姆908包衣的PLGA粒子能延長藥物的半衰期，載藥納米粒給藥1 h后仍有30%藥物存留在血液循環中，而游離藥物給藥5 min后用藥者血液中只剩8%。

其他用以表面改性的試劑包括聚山梨醇酯－20、聚山梨醇酯 －60、聚山梨醇酯 －80、Brij 35、Brij 78、羥丙基纖維素、殼聚糖、薄荷醇等。分別以BrU 78，Myrj 53，Myrj 59表面改性劑對載環孢菌素的聚乳酸納米粒進行表面改性。結果顯示，隨著表面改性劑親水性的增加，巨噬細胞對納米粒的吞噬作用減弱。采用殼聚糖表面改性的PLGA納米粒可以增加大分子在黏膜表面的穿透性，增加納米粒的正Zeta電勢和破傷風類毒素的包裹效率。放射性同位素標記的破傷風類毒素實驗結果表明，表面改性后的納米粒較未經改性的納米粒在穿過鼻和腸的上皮細胞時有好的傳輸能力。

2 延長微粒在吸收部位的停留時間

表面修飾除了可以延長微粒的血漿半衰期外，還可延長微粒在吸收部位的滯留時間。如通過連接配基、抗體、酶等，能使微粒主動富集于相應受體、抗原，酶底物等所在的靶部位，使微粒具有特異靶向能力[14－16]。微粒表面上用陽離子聚合物包衣也易于被細胞攝取。

1)配體修飾

特異性單克隆抗體(mAb)是1975年發現的具有特異靶向性的抗體，將其與不同的化學藥物結合，能獲得具有特異靶向性的藥物分子，實現藥物靶向給藥。然而，由于大部分藥物難以與其偶聯，或直接偶聯會改變藥物的藥理作用及引起免疫反應，故常采用將藥物包封于微球、脂質體等微粒中，然后用其進行表面修飾，以避免藥物理化性質的改變，同時又賦予藥物一定的靶向性，制備出靶向性載藥系統。

雙酸類化合物(diphosphonate)是天然焦磷酸的類似物，對骨組織和鈣化組織有特異性的親和力，能有效抑制骨質吸收[17]，阿侖膦酸鹽是這類藥物典型代表。Sung等[18]用同時接連有阿侖膦酸鹽和mPEG的al－PLGA制備出納米粒，證明其對羥磷灰石具有很強的特異吸附能力，通過改變阿侖膦酸鹽的比例，進一步驗證al－PLGA吸附羥磷灰石能力隨阿侖膦酸鹽含量的減少而減弱;同時也發現mPEG嵌段鏈長度過長會減弱對羥磷灰石的吸附能力。

2)生物多糖修飾

近年來，表面修飾因具有多方面的優勢而受到普遍關注。多糖具有良好的生物相容性和生物降解性;多種活性基團通過共價鍵結合的大分子具有許多獨特的理化特性(如網狀結構、雙親性)，所形成的納米粒或者膠束具有很好的穩定性，可賦予納米粒生物黏附特性，并且能產生很好的靶向性。用殼聚糖和卡波姆等生物黏性聚合物進行納米粒表面修飾也多見報道。

透明質酸(HA)具有良好的生物相容性、可降解性和組織黏附性，并有助于大分子穿過組織黏膜表面。Yadav等[19]用透明質酸與PEG－PLGA反應合成HA－PEG－PLGA，并以此為骨架材料按阿霉素∶PLGA=1∶1的優化處方制備阿霉素HA－PEG－PLGA納米粒與阿霉素PEG－PLGA納米粒，體外釋放研究顯示持續釋放時間達15 d。將兩種微球尾靜脈注入模擬埃列希腹水腫瘤的小鼠，于1，2，4 h 后處死，取腫瘤，肝、脾、肺、腎、腸、心臟、胃和肌肉等組織分析標記放射性元素的分布，顯示給藥1 h后，透明質酸修飾的PLGA納米粒的在腫瘤組織部位富集濃度高于未經修飾的近兩倍，2 h后濃度更高，對腫瘤組織有明顯的靶向性。小鼠體內腫瘤抑制試驗與普通阿霉素注射劑對照，結果表明阿霉素HA－PEG－PLGA納米粒可使腫瘤體積明顯縮小。由于透明質酸是動物細胞膜成分，與單純的聚乙二醇修飾相比，PLGA納米粒更易黏附于腫瘤細胞，并被識別、內攝，提高了藥物的滲透性。

3 結語

多肽、蛋白質類藥物在臨床上常用的劑型仍主要為注射用溶液劑和凍干粉針劑，給藥途徑單一，且必須頻繁給藥，患者的依從性差。微球可使藥物在數周或數月內以一定速率釋放是一類極具開發潛力的新型藥物載體。但目前存在的很多問題，導致許多藥物的微球制劑難以應用于臨床，如藥物包封率及載藥量低，由于微球形狀和體內生物降解等造成的藥物非零級釋放，藥物難以在最合適的時間內釋放;對緩釋系統內藥物的不同釋放程序和速度的研究不足，達不到對某些疾病的綜合預防和治療標準等。其中包封率和釋放是評價微球制劑的兩個最重要的指標，蛋白質多肽類藥物微球的包封率和釋放問題最終還要通過微球修飾來解決。

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