鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化細胞外調節蛋白激酶表達及臨床特征分析

李厚勇 周梁 王璟 叢寧

·臨床研究·

鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化細胞外調節蛋白激酶表達及臨床特征分析

李厚勇 周梁 王璟 叢寧

目的觀察鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的表達，分析ERK活化與臨床特征之間的關系。方法從20例鼻腔黏膜惡性黑色素瘤患者的腫瘤新鮮凍存組織中提取總蛋白，并采用蛋白印跡方法檢測活化ERK的表達。對20例患者進行隨訪，觀察腫瘤復發及頸淋巴結轉移情況。結果20例鼻腔黏膜惡性黑色素瘤組織中，活化ERK表達陽性12例，其中9例術后復發，3例發生頸淋巴結轉移；在8例活化ERK表達陰性患者中，2例術后復發，1例發生頸淋巴結轉移。活化ERK表達陽性患者的復發情況高于ERK表達陰性的患者，差異有統計學意義(Plt;0.05)；而兩者間頸淋巴結轉移差異無統計學意義(Pgt;0.05)。結論鼻腔黏膜惡性黑色素瘤活化ERK表達陽性患者更易復發。(中國眼耳鼻喉科雜志，2011，11：30-32)

黑色素瘤； 鼻腔； 細胞外調節蛋白激酶； 復發； 轉移

惡性黑色素瘤是惡性程度較高的一類腫瘤，好發于皮膚，原發于鼻腔鼻竇者較少。有學者[1-2]對皮膚惡性黑色素瘤進行研究，發現RAS-RAF-ERK途徑信號轉導通路在腫瘤的發生、發展、轉移和復發中起著重要作用；但對鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中RAS-RAF-ERK信號轉導通路及該通路與腫瘤的臨床特征間聯系的研究少有報道。本研究擬采用蛋白印跡法檢測鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中持續活化的細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)，觀察活化ERK在腫瘤組織中的表達情況，并與腫瘤的臨床特征進行比較，以期發現活化ERK的表達與腫瘤臨床特征之間的聯系。

1 資料與方法

1.1 資料 2005年12月至2009年6月我科收治的鼻腔黏膜惡性黑色素瘤手術患者20例,其中男性13例、女性7例；年齡40～75歲，平均55.8歲。臨床表現為鼻塞18例，涕中帶血15例，鼻出血5例。鼻內鏡檢查：鼻腔內褐色或黑色腫物，表面不光滑。病理活組織檢查提示鼻腔黏膜惡性黑色素瘤。所有患者均行手術治療，其中13例行鼻側切開術，5例行部分上頜骨截除術，2例行上頜骨截除術；2例同時行頸廓清術，2例術后半年出現頸淋巴結轉移而行頸廓清術。術中取20例新鮮腫瘤組織并液氮凍存，作為實驗標本。術后病理及免疫組織化學證實為惡性黑色素瘤。以眶外傷行鼻內鏡手術患者的鼻腔黏膜作為健康對照組。按照術中所見的腫瘤范圍及CT診斷情況，根據國際抗癌協會TMN分類標準(1997)，對20例患者進行腫瘤分期，其中2期3例、3期13例、4期4例。所有患者術后隨訪1～3年。

1.2 方法 儀器及試劑：Allegra 25R冰凍離心機 (貝克曼生物公司)，膠片分析儀(上海天能公司)，紫外分光光度計(HACH公司，美國)，總蛋白抽提液(上海普飛生物公司)，兔抗人磷酸化ERK抗體 (Cell signaling technology公司)，丙烯酰胺(Sigma公司，美國)，酶標二抗 (Sigma公司，美國),硝酸纖維素膜(Whatman公司)。

切取液氮凍存標本100 mg,迅速研磨粉碎；然后加300～500 μL 細胞裂解液( 磷酸鹽緩沖液內加蛋白酶和磷酸化酶抑制劑)裂解細胞, 以6 500 ×g離心10 min (r=15 cm,4 ℃)；取上清液測蛋白濃度,并調整各樣本濃度一致。然后采用蛋白印跡法；經蛋白電泳、蛋白質轉印、抗體偶聯物免疫檢測和放射自顯影等步驟，測定鼻腔黏膜惡性黑色素瘤組織中活化ERK1/2蛋白的表達水平。

1.3 統計學處理 采用精確χ2檢驗對本組數據進行統計學處理，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

20例鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中，有12例活化ERK表達陽性；鼻腔黏膜正常組織中無活化ERK表達(附4頁圖①)。12例活化ERK表達陽性患者中，伴頸淋巴結轉移3例，術后復發9例；8例活化ERK表達陰性患者中，伴頸淋巴結轉移1例，術后復發2例。經精確χ2檢驗，兩組間頸淋巴結轉移差異無統計學意義(P=0.363 26)；活化ERK表達組的術后復發病例數高于無活化ERK表達組，兩組間差異有統計學意義(P=0.036 68)。

12例活化ERK表達患者中，腫瘤分期2期2例，3期8例，4期2例；8例無活化ERK表達患者中，腫瘤分期2期1例，3期4例，4期2例。經χ2檢驗，結果顯示ERK表達與腫瘤分期間差異無統計學意義(χ2=1.135，Pgt;0.05)。

3 討論

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是一系列絲氨酸/蘇氨酸激酶，可磷酸化其他細胞質蛋白，并從胞質移位至細胞核而調節轉錄因子的活性。在人類細胞內，高度保守的MAPKs是信號從細胞表面轉導至細胞核內部的重要傳遞者，主要參與胚胎發育、細胞分化、細胞增殖和細胞死亡的過程。在MAPKs家族中[3-5]，ERK是最先發現并被了解最多的成員。ERK包括兩種異構體：ERK1和ERK2(分別為p44和p42)。許多絲裂原可激活ERK級聯反應，如上皮生長因子、血小板衍生生長因子、血栓素A2、血管緊張素、轉化生長因子和胰島素等。生長因子與細胞表面的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)結合，誘發生長因子受體胞質中的酪氨酸殘基自主磷酸化，導致受體二聚體化與活化。磷酸化的酪氨酸殘基可以與生長因子受體結合蛋白2(Grb2)結合，并通過該蛋白的SH2結構域與鳥嘌呤核苷酸交換因子(Sos)形成復合物。細胞表面的生長因子受體具有募集Grb2與Sos復合物的能力。Sos與生長因子受體結合的過程中，移位至胞質并與RAS相互作用，促進RAS與GTP結合，從而使RAS被激活而成為具有功能活性的RAS蛋白。GTP偶聯的RAS蛋白能與RAF結合，并以一種目前未知的作用方式激活RAF蛋白。活化的RAF蛋白即MAPK激酶激酶(MAPKKK)可以磷酸化并激活MAPK激酶(MEK)，活化的MEK可以進一步磷酸化并活化ERK1/2[4-5]。

目前研究發現，RAS-RAF-MAPK信號轉導通路在皮膚惡性黑色素瘤的發生、發展中起著重要作用[6-11]。癌基因RAF可以調控Raf 蛋白的合成，Raf蛋白是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。活化的RAF蛋白可以激活MAPK信號通路，導致ERK1/2的持續活化[3，5,12]。ERK是MAPK/ERK路徑的效應子[13],活化的ERK可以磷酸化ELK-1 ( Ets like transcription factor-1)、c-FOS、c-JUN、NF-κb(nuclear factor of kappa b)等蛋白[5，13],在細胞多種正常生理過程中(如細胞生長、發育、分裂、死亡等)發揮作用。ERK過度活化后,還可通過影響cyclin、MITF (microphthalmia- associated transcription factor)、MMP (matrix metalloprotease)等因子促使細胞生長過度和分化不良,致細胞間黏附力下降，促進腫瘤的發展[4-5，13]。

本研究發現，在鼻腔黏膜惡性黑色素瘤中，ERK1/2的活化率達60%，而正常鼻腔黏膜組織中無活化的ERK，說明ERK信號通路的持續活化與鼻腔黏膜惡性黑色素瘤的發生、發展有較為密切的關系。結合本文隨訪結果，在12例活化ERK表達的鼻腔黏膜惡性黑色素瘤患者中，術后復發9例，伴頸淋巴結轉移者3例；而在8例無活化ERK表達的患者中，術后復發2例，伴頸淋巴結轉移者1例。經χ2檢驗，兩組間在術后復發率上差異有統計學意義，而在頸淋巴結轉移率上差異無統計學意義，提示活化ERK與鼻腔黏膜惡性黑色素瘤的復發關系密切。12例活化ERK表達患者中，腫瘤分期2期2例，3期8例，4期2例；8例無活化ERK表達患者中，腫瘤分期2期1例，3期4例，4期2例。采用χ2檢驗，兩組間在腫瘤分期間的差異無統計學意義。本文研究提示，可以通過檢測ERK的活性，推測鼻腔黏膜惡性黑色素瘤的復發可能，并對惡性黑色素瘤復發的早期發現和干預提供新的研究方向和思路。

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2010-10-11)

(本文編輯 楊美琴)

·消息·

第48屆國際臨床視覺電生理協會年會在澳大利亞召開

第48屆國際臨床視覺電生理協會(ISCEV)年會于2010年11月6—10日在澳大利亞西部城市珀斯的Fremantle舉行，來自26個國家的300多名代表出席了本次年會。代表們就視覺電生理各個方面的內容以大會發言、展板和病例討論等形式進行了廣泛深入的交流探討。本次年會Emiko Adachi Award Lecture的演講嘉賓是日本名古屋愛知醫科大學的Yozo Miyake教授，他作了題為“建立完全型和非完全型先天性靜止性夜盲以及隱匿性黃斑營養不良臨床新概念”的演講。澳大利亞國立大學的Trevor Lamb教授做了“視網膜電圖不同成分的細胞來源”的主題演講。美國密西根大學的Heckenlively教授應邀做了“預后因素在Stargardt病臨床分析和表型間的關系”的專題報告。多焦視覺電生理發明人Erich Sutter教授的專題講座是“探索視覺電生理新的可能性”。大會發言交流的主要內容涉及視覺電生理在神經眼科的應用，多焦電生理技術進展，影響視覺系統的藥物毒性監控，兒童電生理，視覺電生理擴展程序的應用，視網膜疾病的電生理、基因和影像學，動物模型的電生理和影像學等方面。專為鼓勵青年科學家設立的Eberhard Dodt Memorial Award，今年授予來自澳大利亞墨爾本的Yu Xiang George Kong。年會還就2013年第51屆ISCEV年會的地點讓參與競選的中國重慶和新加坡作了參選介紹，香港中文大學的賴旭佑教授代表中國作了精彩的申辦陳述，中華眼科學會視覺生理組組長陰正勤教授代表中華眼科學會主任委員趙堪興教授向各位代表發出熱情邀請。新加坡的代表也作了富有吸引力的陳述。按照協會規定，最后當選的舉辦城市由所有會員投票決定。

本次年會在主辦方的精心安排下取得圓滿成功，會議學術氣氛濃厚，與會者在充分學習交流的同時，也享受東道主的熱情好客。傳統的ISCEV奧林匹克競賽為緊張的會議安排增添不少輕松，愉快的氣氛，中國代表參與的亞洲隊喜獲銅獎。

王敏

Analysisofextracellularregulatedproteinkinaseactivationandclinicalcharacteristicsinpatientswithnasalmucosamelanomas

LIHou-yong,ZHOULiang,WANGJing,CONGNing.DepartmentofOtorhinolaryngology,EyeEarNoseandThroatHospital,FudanUniversity,Shanghai200031,China

Corresponding author：LI Hou-yong,Email:lihouy2000@yahoo.com.cn

ObjectiveTo determine the expression of activated extracellular regulated protein kinases (ERK) and to analyze the relationship between the ERK activation and clinical characteristics in patients with nasal mucosa melanomas.MethodsTwenty nasal mucosa melanomas samples were collected. Total protein was obtained and the activated ERK was detected by Western blot. These patients were followed-up for 1 to 3 years.ResultsThe phosphorylated ERK protein was detected in 12 samples. In 12 patients with ERK activation, the recurrence and cervical lymph node metastasis after surgery was observed in 9 cases and 3 cases respectively. In 8 patients without ERK activation, the recurrence and cervical lymph node metastasis after surgery was observed in 2 cases and 1 case respectively. There was a significant difference in recurrence (Plt;0.05), but not in cervical lymph node metastasis (Pgt;0.05) between patients with or without ERK activation.ConclusionsIn nasal mucosa malignant melanomas, the recurrence in patients with ERK activation was possibly more than that in patients without ERK activation.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2011,11:30-32)

Melanoma; Nasal; Extracellular regulated protein kinases; Recurrence; Metastasis

復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院耳鼻喉科 上海 200031

李厚勇(Email：lihouy2000@yahoo.com.cn)