PCR依賴型方法構建高質量酵母基因突變文庫

王睿，喻曉蔚，徐巖，郅巖，孔宇

1 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122

2 江南大學醫藥學院，無錫 214122

酶的體外定向進化屬于蛋白質的理性設計，它無需事先了解酶的空間結構和催化機制，只需人為地創造特殊的條件，模擬自然進化機制 (隨機突變、重組和自然選擇)，在體外改造酶基因，并定向選擇出所需性質的突變酶[1]。酶的體外定向進化技術極大地拓展了蛋白質工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決理性設計所不能解決的問題，為酶的結構與功能研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業、農業、食品和醫藥等領域逐漸顯示其生命力[2-6]。

酵母是表達外源基因的最重要的表達系統之一。酵母作為單細胞生物，在生產和操作上具有優越于細菌表達系統的易于大規模擴增的特點，又具有真核細胞對蛋白質的翻譯后加工及修飾的作用[7-8]。酵母表達系統的表達載體主要分為2種，即整合型載體和附加型載體。整合型載體不含自主復制序列，轉化入酵母后整合到酵母宿主菌的染色體上，具有穩定性好的優點，尤其適合于工業化生產。而附加型載體能夠在酵母體內自主復制，達到較高的拷貝數，但是在非選擇條件下多不穩定[9]。

定向進化的研究中常用大腸桿菌為宿主構建基因突變文庫，而酵母使用較少。而對于在大腸桿菌表達體系中表達效果不好的酶，就需要嘗試其他表達體系。前期研究表明華根霉脂肪酶在大腸桿菌中表達無法進行翻譯后修飾，比活很低，而無法體現出脂肪酶應有的酶學性質，篩選困難[10]；……