基于人工神經網絡-遺傳算法的樟芝發酵培養基優化

陸震鳴，何喆，許泓瑜，史勁松，許正宏

1 江南大學醫藥學院 制藥工程研究室，無錫 214122

2 江南大學醫藥學院 生物活性制品加工工程研究室，無錫 214122

樟芝Antrodia camphorata，又名牛樟菇、牛樟芝，是一種生長于臺灣牛樟樹 Cinnamomum kanehirai腐朽內壁的藥用絲狀真菌[1]。研究表明，樟芝具有抗腫瘤、保肝、抗炎癥、調節免疫等良好生物活性[2]。由于樟芝自然產量極低，子實體人工栽培技術尚未產業化，導致近年來樟芝子實體十分昂貴，所以采用生物技術方法液態培養獲得樟芝發酵產物是目前的主要方法。有學者以生物量或活性物質產量為指標對樟芝的發酵條件進行了優化[3-5]，但是不同研究報道的樟芝發酵條件及產量性狀相差較大。發酵規模的不同、菌種和接種方法的差異以及發酵條件和發酵過程控制策略的差異等可能是造成不同研究結果差異明顯的主要原因。

絲狀真菌的發酵過程具有影響因素較多、高度非線性和復雜性等特征[6]。人工神經網絡 (ANN) 為研究非線性問題提供了強有力的解決辦法。與回歸方程需要預先給定函數不同，ANN是以實驗數據為基礎經過有限次的迭代計算而獲得的一個反映實驗數據內在聯系的數學模型，具有極強的非線性處理能力。遺傳算法 (GA) 是借鑒生物界自然選擇和群體進化機制形成一種全局尋優算法，通過 GA可以對 ANN模型進行全局性的訓練，最終得到最佳方案。ANN-GA技術在故障診斷、生物行為模仿、廢水處理等多個行業都已有應用報道[7]，但在絲狀藥食用真菌發酵研究領域尚未見應用報道。

本研究以樟芝模式菌株 Antrodia camphorata ATCC 200183為研究對象，考察了樟芝孢子萌發生長及菌球形成的過程。同時采用旋轉中心組合實驗設計 (RCCD) 考察了孢子濃度培養基組成對樟芝生物量的顯著影響。進一步比較了ANN和響應面法 (RSM) 對樟芝發酵過程的建模效果，并用 GA對ANN模型進行結果尋優，從而獲得最優培養基組成。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

樟芝Antrodia camphorata ATCC 200183，本實驗室保藏。

1.1.2 培養基

斜面培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然。

發酵培養基：葡萄糖濃度、蛋白胨濃度和黃豆粉濃度按照實驗設計值，MgSO41.5 g/L，KH2PO43.0 g/L，pH 4.5。

1.1.3 儀器

BX60型光學顯微鏡，日本 Olympus公司；冷凍干燥機，美國Labconco公司；2135型組織切片機，德國 Leica公司；DHZ-DA型恒溫搖床，太倉市實驗設備廠。

1.2 方法

1.2.1 樟芝發酵方法

孢子接種物的制備：用接種鏟將樟芝菌絲體從PDA斜面上轉接入PDA平板，26 ℃培養21 d。取10 mL無菌發酵培養基將平板上的樟芝孢子洗下，采用血球計數板計數并稀釋后作為種子液用于發酵實驗[8]。

發酵方法：500 mL三角搖瓶中裝100 mL發酵培養基，滅菌后接入一定數量的樟芝孢子，100 r/min、26 ℃培養8 d。

1.2.2 生物量測定方法

發酵結束的樟芝發酵產物用 6層紗布過濾得到菌球，經去離子水洗滌后進行冷凍干燥，稱重并計算生物量。

1.2.3 形態觀察

發酵過程中，采用光學顯微鏡對發酵液中樟芝的不同形態進行觀察。樟芝菌球內部結構觀察采用切片方法：菌球從發酵產物中分離后用4 ℃的生理鹽水進行漂洗，取一定數量的樟芝菌球于10%甲醛溶液中固定 24 h后用乙醇進行脫水并包埋于石蠟塊中。然后用組織切片機將其切成5 μm薄片，薄片采用H&E染料染色。H&E染色步驟如下：溶解蠟(二甲苯洗3次，每次3 min；無水乙醇洗3次，每次3 min；95%乙醇洗2次，每次3 min；70%乙醇洗2次，每次3 min)；Haematoxylin染色3 min；水洗10 min；Eosin染色1 min；70%乙醇洗1次，3 s；95%乙醇洗2次，每次3 s；無水乙醇洗2次，每次3 s; 二甲苯洗3次，每次3 s；蓋片、陰干后以光學顯微鏡觀察。

1.2.4 RCCD實驗設計

前期單因素實驗研究結果表明碳源、氮源、碳氮比和孢子接種濃度是影響樟芝生物量的顯著因素。為了確定樟芝發酵的最佳培養基組成，本實驗選用四因素三水平的旋轉中心組合實驗設計，實驗設計表和實驗結果見表1。

1.2.5 RSM模型的建立

采用Design Expert 7.1.0軟件對表1中的實驗數據進行回歸分析，并通過最小二乘法擬合二次多項方程，建立二次回歸模型[9]。該模型方程為：

其中Y為響應值 (生物量)，β0、βi、βii和βij為方程系數，Xi和Xj為自變量編碼值。多項式模型方程擬合的精度和泛化能力由回歸系數R2表征。

1.2.6 ANN模型的建立

采用反向傳播 (BP) 方法建立ANN模型。模型中含有輸入層、隱含層和輸出層，以表 1中樟芝孢子濃度和發酵培養基中葡萄糖、蛋白胨、黃豆粉的濃度為輸入值，以發酵終止時樟芝生物量為輸出值。隱含層和輸出層的傳遞函數分別為 tansig函數和purelin函數，同時用trainbr算法訓練網絡，當均方誤差 (MSE) 達到1×10?3時，網絡停止訓練。

為了評價模型的擬合能力和預測能力，分別計算所建立模型的均方根誤差 (RMSE)、方差 (R2) 和預測標準誤差 (SEP)[10]：

1.2.7 GA優化

本實驗采用浮點編碼的方式對發酵過程中孢子濃度、葡萄糖含量、蛋白胨含量和黃豆粉含量 4個因素在其各自取值范圍內進行ANN模擬推算，并以模型擬合值作為遺傳算法的適應性函數，進行選擇、變異、交換操作。樟芝生物量越高，則適應度越高。程序通過MATLAB 7.6軟件和其附帶的GA遺傳算法工具箱編寫完成。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中樟芝形態的觀察

樟芝在搖瓶培養過程中的形態變化過程見圖1。圓柱狀的樟芝孢子 (2 μm×5~10 μm) (圖1A) 接入新鮮培養基后開始萌發并形成絲狀菌絲 (圖1B)，菌絲不斷生長并相互纏繞形成蓬松的菌絲團 (圖1C)。菌絲團進一步形成菌球 (直徑0.5~2.0 mm) (圖1D)，隨后以菌球的形式在搖瓶中至發酵結束。通過切片觀察發現，菌球內外兩層的菌絲密度不同，內層的菌絲較外層疏松 (圖 1E)，這可能是由于菌球內部傳質、傳氧受限所致[11]。樟芝發酵過程中孢子、菌絲、菌絲團、菌球的形態變化過程以及菌球內部的不均勻性都說明了樟芝發酵體系的復雜性，對其過程的建模需要采用RSM、ANN等非線性處理工具。

表1 RCCD實驗設計表與實驗結果Table 1 Design matrix and results obtained in RCCD

圖1 發酵過程中樟芝的不同形態Fig. 1 Different morphological forms of Antrodia camphorata in submerged culture. (A) Spore. (B) Mycelia. (C) Mycelium regiment. (D) Pellets. (E) Section of Antrodia camphorata pellets.

表2 二次模型的方差分析結果Table 2 ANOVA of the fitted quadratic model

2.2 響應面分析

利用Design-Expert軟件對表1中的實驗數據進行多元回歸擬合，表 2為回歸分析結果。回歸方差分析顯著性檢驗表明，該模型回歸顯著 (R2= 0.915 6)，說明回歸方程能夠用于表1中實驗數據的擬合。“lack of fit”值為0.000 4，說明模型預測值與實際值不擬合的概率為顯著，因此二次模型可能難以充分描述樟芝的發酵過程。“Prob＞F”值小于0.05說明該項在95%的置信區間內顯著。本研究中，X1、X2、X3、X4、X12、X14、X24、X34、X12、X22、X32、X42是顯著項，獲得回歸方程為：

Y=5.68–0.17X1+0.10X2+0.22X3+0.14X4+0.14X1X4+0.15X3X4–0.42X12–0.14X22–0.19X32–0.14X42。

2.3 人工神經網絡建模

以表1中的實驗數據作為BP神經網絡的訓練樣本，根據實驗因素的個數和優化指標的個數設計神經網絡的結果，然后用實驗數據對神經網絡進行訓練。為防止過擬合情況發生，在滿足訓練精度的情況下，中間隱層節點數目盡可能少選，本實驗選擇的隱含層節點數為 6。隱含層和輸出層的傳遞函數分別為tansig函數和purelin函數，同時用trainbr算法訓練網絡，當均方誤差達到1×10?3時，網絡停止訓練。實驗結果表明，樣本訓練能較快地達到收斂(圖2)。模型模擬結果與實驗值的擬合度較好 (圖3)，兩者之間的相對誤差在 5%以內，說明建立的神經網絡性能良好，不需要再添加訓練樣本。

2.4 RSM模型和ANN模型的比較

為了對建立的ANN模型和RSM模型進行比較，分別計算兩種模型的RMSE、R2和SEP。結果表明ANN模型的 RMSE、R2和 SEP分別為 0.03、0.99和0.53%，而RSM模型的RMSE、R2和SEP分別為0.20、0.91和 4.06%。通常較高的RMSE和R2說明模型對實驗數據擬合能力較好，而SEP越低則說明模型具有越好的預測能力和外推能力。與RSM模型相比，本實驗中ANN模型對樟芝發酵過程的實驗數據擬合的較好，并且具有更好的模型預測能力和外推能力。這可能是由于RSM模型建立的數學回歸模型屬于二次多項式，因此擬合能力有限，無法很好地反映樟芝發酵過程中各因素與指標之間的高度非線性關系。而ANN模型不需要像回歸方程那樣要預先給定函數，而是以實驗數據為基礎經過有限次的迭代計算而獲得的一個反映實驗數據內在聯系的數學模型，具有極強的非線性處理能力。因此，本實驗最終采用ANN模型作為GA優化的適度值函數，用于求出各個因素的最佳組合。

2.5 遺傳算法優化

遺傳算法是借鑒生物界自然選擇和群體進化機制所形成的一種隨機搜索算法，它以其高效、自適應及全局搜索的優勢在很多領域中得到應用。它的搜索面廣，尋優速度快，得到的結果能以較大概率接近全局最優解[12]。因此，通過遺傳算法可以對ANN模型進行全局性的訓練，最終得到最佳方案。本實驗中，遺傳算法尋優過程見圖4。經過61次優化計算，遺傳算法得到的樟芝生物量理論最大值為：6.2 g/L，并獲得發酵最佳接種量及培養基組成：孢子濃度1.76×105個/mL，葡萄糖29.1 g/L，蛋白胨9.4 g/L，黃豆粉2.8 g/L。在該培養條件下，經過3次重復實驗得到樟芝的生物量為 (6.1±0.2) g/L，說明ANN-GA預測的培養基組成起到了較好的實驗效果。

圖2 BP神經網絡訓練過程Fig. 2 Training course of BP neural network.

圖3 實驗生物量和RSM、ANN模型預測生物量的比較Fig. 3 Comparison of experimental biomass and predicted biomass by RSM and ANN.

圖4 遺傳算法中最優適度值和平均適度值的變化過程Fig. 4 Evolution of the best and mean fitness in the GA.

3 結論

樟芝在生長過程中形態變化的多樣性說明其發酵過程的復雜性和非線性。在本文所研究的體系中，成功應用ANN-GA方法描述了樟芝發酵培養基與生物量的關系，并由此模型預測了最佳生物量及培養基配方。ANN-GA方法不僅能有效地提高生物量，顯著地降低培養基成本，而且可大大減少繁瑣的實驗工作量及縮短研究周期，這也為優化其他絲狀真菌等的復雜非線性發酵過程提供了方法借鑒。

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